蒼鷺致病性沙門菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

冷 闖，鄧舜洲，張文波，蔣新華

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌330045）

沙門菌病（Salmonellosis）是由沙門菌屬中的一種和幾種致病沙門菌（Salmonella）引起的人和多種動(dòng)物感染的急性和慢性疾病的總稱，是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一［1］。美國總統(tǒng)奧巴馬支持了歐洲食品安全局的觀點(diǎn)，認(rèn)為沙門菌是引起人類食源性傳染病的重要原因，而農(nóng)場(chǎng)飼養(yǎng)的動(dòng)物和動(dòng)物源性食品是人類沙門菌病的重要傳染源［2］。蒼鷺（Ardea cinerea）屬鸛形目，鷺科、鷺屬，是一種中型涉禽，在遼寧為夏候鳥［3］。養(yǎng)殖戶由于缺乏珍禽養(yǎng)殖技術(shù)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。2001年4月江西省九江市鄱陽湖地區(qū)某規(guī)模在1 500只左右的蒼鷺養(yǎng)殖場(chǎng)，每天死亡蒼鷺30只左右，日齡在15日齡到20日齡，并且死亡數(shù)量呈遞增趨勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)送檢的10只患病蒼鷺進(jìn)行系統(tǒng)診斷，確定為沙門菌所致。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 高壓滅菌器、恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡、搖床、冰箱。

1.1.2 培養(yǎng)基 普通肉湯液體培養(yǎng)基，S.S.瓊脂培養(yǎng)基，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，8%兔鮮血脫纖維瓊脂培養(yǎng)基。培養(yǎng)基均為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室自配，并檢驗(yàn)合格。

1.1.3 藥敏紙片 環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、青霉素G、四環(huán)素、紅霉素、甲氧芐啶、頭孢曲松、林可霉素、阿米卡星頭孢唑林、氧氟沙星、利福平、哌拉西林、多黏菌素B、壯觀霉素、頭孢拉定、卡那霉素、呋喃唑酮、氨芐青霉素、強(qiáng)力霉素、慶大霉素。藥敏紙片直接均為6mm左右，以上藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.4 微量生化管 硫化氫、肌醇、水楊苷、枸櫞酸、葡萄糖、甘露醇、側(cè)金花、硝酸鹽、蔗糖、精氨酸、V－P、七葉苷、阿拉伯糖、麥芽糖、乳糖、鳥氨酸。以上微量生化管，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.5 試驗(yàn)動(dòng)物 6周齡雌性昆明系小鼠5只，購自南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。

1.2 試驗(yàn)方法與步驟

1.2.1 病料采集 送檢的病蒼鷺進(jìn)行查看，觀察到蒼鷺肛門下方羽毛都被白色糞便糊住，拉稀很嚴(yán)重，剖檢后仔細(xì)查看病理變化，發(fā)現(xiàn)所有剖檢的病例都存在肝臟腫大，出血嚴(yán)重，脾臟腫大，腸道漿膜出血，肌胃與腺胃交界處片狀出血非常嚴(yán)重。挑取病變最典型的肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離。并且做好記錄，拍照留底。

1.2.2 細(xì)菌分離及純化 剖檢后采取肝臟用劃線接種法接種于8%兔鮮血脫纖維瓊脂培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12～24h，進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)。根據(jù)菌落形態(tài)及顯微鏡觀察結(jié)果，再挑取單個(gè)典型菌落劃線接種于8%兔鮮血脫纖維瓊脂平板37℃進(jìn)行多次純化培養(yǎng)。

1.2.3 初步鑒定 通過多次細(xì)菌分離純化后，挑取最典型的菌落進(jìn)行涂片、革蘭染色以及鏡檢，首先通過肉眼觀察培養(yǎng)基上細(xì)菌菌落形態(tài)、大小、透明度以及借助顯微鏡觀察細(xì)菌的特征。

1.2.4 培養(yǎng)特性觀察 在純培養(yǎng)平板上挑取典型菌落用劃線接種法分別接種于S.S.瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12～24h，觀察長(zhǎng)出細(xì)菌的菌落形態(tài)以及在各種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。

1.2.5 擴(kuò)大培養(yǎng) 將普通液體肉湯培養(yǎng)液分裝于10支高壓滅菌的試管中，挑取兔鮮血平板上分離純化后的單個(gè)菌落于液體培養(yǎng)基中，操作時(shí)注意無菌條件，接種完后把試管放進(jìn)搖床中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，條件是37℃，200r／min，培養(yǎng)24h。

1.2.6 試驗(yàn)動(dòng)物攻毒 用擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液進(jìn)行小鼠腹腔注射，兩只小鼠注射0.5mL，兩只小鼠注射0.2mL，1只小鼠注射0.5mL滅菌生理鹽水作為對(duì)照，攻毒時(shí)注意腹腔注射盡量避免把菌液注射到小鼠皮下，影響小鼠發(fā)病及死亡時(shí)間，做好染色標(biāo)記。

1.2.7 試驗(yàn)動(dòng)物剖檢及細(xì)菌分離 小鼠攻毒之后注意觀察其精神狀態(tài)和死亡情況，待小鼠死亡后，采用常規(guī)剖檢方法先將小鼠腹腔打開，再打開胸腔，觀察各個(gè)臟器的病理變化，摘下肝臟以備分離細(xì)菌所用，待剖檢后，進(jìn)行細(xì)菌分離操作，以上操作都要求無菌。

1.2.8 致病菌的鑒定 從死亡小鼠肝臟分離的細(xì)菌進(jìn)行革蘭染色鏡檢，對(duì)比從原始病料中分離的細(xì)菌，最終確定是否是主要致病菌。

1.2.9 生化鑒定 通過純培養(yǎng)的細(xì)菌選擇典型菌落接種于8%兔鮮血瓊脂固體試管斜面培養(yǎng)基上置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24h，用鉤菌環(huán)挑選典型單個(gè)菌落接種于微量生化鑒定管中，接種完后，微量生化管放于滅菌平皿中切忌要保持水平放置，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24～48h，進(jìn)行觀察，記錄結(jié)果。

1.2.10 藥敏試驗(yàn) 采用瓊脂紙片擴(kuò)增法，用高壓滅菌后的棉拭子蘸取擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液均勻涂布于8%兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，為了保證涂布均勻，需要重復(fù)涂布3次，待水分干后，貼上藥敏紙片，輕輕按壓，確保其貼穩(wěn)，防止掉落和移動(dòng)，注意用鑷子夾取藥敏紙片貼于平板上時(shí)要確保藥敏紙片完全與培養(yǎng)基接觸，以免影響藥物擴(kuò)散不均勻。一個(gè)平皿貼7片紙片，最中間一塊，其余6塊均勻分布其周圍。貼好藥敏紙片后放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12～24h，觀察測(cè)量抑菌圈的大小，抑菌圈≧20mm為極度敏感；15～20mm為高度敏感；14～10mm為中度敏感；10mm以下大于0為低度敏感；等于0為不敏感。藥敏試驗(yàn)操作方法按2005年版CLSI／NCCLS M100－S15所述方法進(jìn)行。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 病原菌的鑒定 從蒼鷺肝臟分離的細(xì)菌在8%兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基上置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)12～24h，生長(zhǎng)菌落形態(tài)都為邊緣整齊、光滑、濕潤(rùn)、半透明、略隆起的細(xì)小圓形菌落，沒有出現(xiàn)溶血環(huán)；S.S.瓊脂培養(yǎng)基上細(xì)菌生長(zhǎng)良好，長(zhǎng)成半透明、圓形、菌落中間有黑點(diǎn)的小菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上都長(zhǎng)出半透明、光滑小菌落，挑取典型菌落進(jìn)行革蘭染色，結(jié)果為革蘭陰性菌，形態(tài)都為長(zhǎng)桿狀或短桿狀菌落，多數(shù)散在。通過細(xì)菌形態(tài)觀察、染色鏡檢及生化鑒定結(jié)果最終得出該細(xì)菌為沙門菌。

2.2 試驗(yàn)動(dòng)物攻毒 將細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)物對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射后，小鼠全部在12h之內(nèi)死亡，表中死亡時(shí)間為2只小鼠平均死亡時(shí)間，具體結(jié)果見表1。

表1 動(dòng)物攻毒試驗(yàn)

2.3 試驗(yàn)動(dòng)物病理剖檢及致病菌鑒定 通過對(duì)死亡小鼠進(jìn)行病理剖檢均發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟腫大、壞死，心外膜少量點(diǎn)狀出血，腸道黏膜嚴(yán)重出血，腸壁變薄、變黃，臌氣。剖檢完死亡小鼠取下其肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革染色再鏡檢觀察，發(fā)現(xiàn)菌落形態(tài)大小、色澤都和原分離菌一致，鏡檢也發(fā)現(xiàn)和原分離菌的形態(tài)相同，因此得出原分離細(xì)菌為該病例主要致病菌。

2.4 生化鑒定結(jié)果 見表2。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 見表3。

表2 生化鑒定

表3 藥敏試驗(yàn)

3 討論

沙門菌病和大腸桿菌病屬于條件致病菌，人和動(dòng)物的沙門菌病一直是一個(gè)世界性問題［4］，沙門菌菌型繁多，分布廣泛，是一種重要的人畜共患病的病原體［5］。沙門菌對(duì)于我國畜牧業(yè)的威脅越來越大，而且沒有很好的有效控制辦法，長(zhǎng)期以來，以治療、預(yù)防疾病和促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)為目的，不合理使用抗生素，導(dǎo)致抗生素過度使用或?yàn)E用，在抗生素的選擇性壓力下，沙門菌耐藥性不斷上升，這已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題［6］。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)［1］指出，沙門菌耐藥的生化反應(yīng)機(jī)制主要有5種：酶對(duì)抗菌藥物的修飾或破壞；外輸泵介導(dǎo)抗菌藥物的主動(dòng)外排；抗菌藥物的滲透障礙，導(dǎo)致藥物攝取減少；藥物作用靶位的改變；建立新代謝途徑，沙門菌發(fā)生耐藥性常常不是一種生化反應(yīng)機(jī)制起作用，而是兩個(gè)或多個(gè)不同的生化反應(yīng)機(jī)制共同作用。從而可以看出，要解決沙門菌的耐藥性問題面臨非常嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

本試驗(yàn)分離到的沙門菌可能是由于種蛋帶毒或者是由于野生放養(yǎng)于沼澤地而感染沙門菌，鑒于這種可能性，必須對(duì)種蛋和沼澤地的泥水進(jìn)行檢測(cè)，鑒于我國國情，在生產(chǎn)中常用國標(biāo)法，有條件的單位應(yīng)用自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀，ELISA，PCR試劑盒檢測(cè)［7］，做到從源頭消滅病原菌，才能更好地控制沙門菌病。蒼鷺養(yǎng)殖屬于特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖，養(yǎng)殖規(guī)模小，養(yǎng)殖戶數(shù)量少，可以借鑒的經(jīng)驗(yàn)更是很少，很多經(jīng)驗(yàn)都是靠養(yǎng)殖戶自己摸索，這無疑會(huì)走很多彎路，本試驗(yàn)得出的一些數(shù)據(jù)可能對(duì)于蒼鷺養(yǎng)殖能起到一個(gè)參考作用。

鑒于本試驗(yàn)得出的結(jié)論，對(duì)該病例的治療與預(yù)防提出以下建議措施：用環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、甲氧芐啶進(jìn)行交替使用拌料和飲水，使用多維、中草藥等增強(qiáng)免疫力的藥物進(jìn)行輔助治療；盡量減小養(yǎng)殖密度，保持空氣流通；對(duì)于投喂的魚粉飼料要進(jìn)行把關(guān)檢測(cè)，防治霉變及病菌污染。

［1］張凌云，李昆鵬，張林波.沙門菌生化耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.吉林農(nóng)業(yè)，2011，3（253）：64.

［2］Roger Mann，Anitox.salmonella control in the spotlight［J］.Pig progress，2010，26（1）：18－20.

［3］袁宏宇，周正，任秀奇，等.蒼鷺繁殖生態(tài)習(xí)性研究［J］.遼寧林業(yè)科技，2003，6：10－12.

［4］Kerstein F K，Motarjemi Y，Bettcher.Foodborne disease control：A transnational challenge.Emerging Infectious disease.http：／lwww.cdc.gov／foodsafety／facts.html.

［5］Timoth，Jones，Diane Eigsti Gerber，Perceived Etiology of Foodborne Illness Among Public Health personnel，http：／／www.cdc.gov／ncidod／disease／eid／index.Htm.

［6］王曉泉，焦新安，陳祥，等.江蘇部分地區(qū)食源性和人源沙門菌的多重耐藥性研究［J］.微生物學(xué)報(bào)，2007，47（2）：221－227.

［7］孫雨，卜仕金，王美君.沙門菌的毒理作用機(jī)制及其檢測(cè)方法的研究進(jìn)展［J］.口岸衛(wèi)生控制，2008，14（2）：56－58.