禁水致脫水對(duì)大鼠睪丸網(wǎng)影響的形態(tài)定量研究

楊正偉，尹雨婷，郭 洋，朱金釵

(川北醫(yī)學(xué)院形態(tài)定量研究室，四川 南充 637000)

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筆者實(shí)驗(yàn)室前期的研究［1－2］顯示，成年大鼠嚴(yán)重高糖高脂血癥5 ～6 周可能導(dǎo)致睪丸內(nèi)精子釋放障礙，睪丸網(wǎng)增厚。這提示睪丸內(nèi)精子向附睪的輸送可能受到一定程度的影響。鑒于嚴(yán)重高糖高脂血癥勢(shì)必引起脫水，而脫水又可能引起睪丸液(精子輸送的載體)分泌減少，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)急性脫水模型(禁水)來(lái)初步探討脫水是否會(huì)影響精子的輸送［3］。本文利用該實(shí)驗(yàn)所獲得的標(biāo)本(另一側(cè)睪丸)，同時(shí)研究這個(gè)脫水模型是否也會(huì)引起睪丸網(wǎng)的形態(tài)改變，以推測(cè)精子輸送障礙(如果有的話)是否與精子輸出的狹窄通道(睪丸網(wǎng))有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與切片

51 ～52 天齡雄性SD 大鼠隨機(jī)分成兩組，1 組常規(guī)給食(顆粒飼料)給水，1 組只給食不給水，均單籠飼養(yǎng)，4 ～5 d 后取材。一側(cè)(左或右，隨機(jī)交替確定)睪丸用于另一研究［3］，另一側(cè)用于本文。本文所用睪丸經(jīng)Bouin 液浸潤(rùn)固定2 d 后用70%乙醇保存，約半年后切取睪丸組織塊。

把每個(gè)睪丸的后上突出區(qū)域［2］看作一個(gè)水平面，以此為中心，沿水平面上的等距隨機(jī)方向［4］(一個(gè)睪丸一個(gè)方向)并垂直于水平面切取一個(gè)組織薄片(組織塊)，約2 mm 厚，貫穿整個(gè)睪丸，剖面大致垂直于水平面。

組織塊經(jīng)脫水后用甲基丙烯酸樹(shù)脂(2-hydroxyethyl methacrylate，德國(guó)Leica Microsystems Nussloch GmbH 產(chǎn)品)包埋，然后沿組織塊剖面方向切片。前面大約200 μm(總厚)的切片不要，接著切6 張連續(xù)切片(每張10 μm 厚)用于觀測(cè)。切片用PAS(過(guò)碘酸與Schiff 試劑)和蘇木精染色。

1.2 切片觀察與測(cè)量

從每個(gè)睪丸選擇1 張染色效果較好的切片用于照相、拼圖。用體視學(xué)圖像系統(tǒng)(丹麥Visiopharm產(chǎn)品)所配置的日本Olympus 的BX51 型光學(xué)顯微鏡和20 ×物鏡(UplanSApo 型物鏡，其數(shù)值孔徑為0.75)觀察切片并照相(數(shù)碼)。照相前仔細(xì)觀察確定整個(gè)睪丸網(wǎng)的分布范圍，然后在有睪丸網(wǎng)的整個(gè)區(qū)域(包括鄰近的被膜與生精小管)重疊照相，用Photoshop 進(jìn)行人工拼圖(圖像合成)后把整個(gè)睪丸網(wǎng)分布區(qū)域圖像打印在1 張A4 紙上，圖像放大倍數(shù)平均為89.0(44 ～155)。

在1 張A4 紙大小的透明膠片上用激光打印機(jī)打印一組間距為5 mm 的平行直線(測(cè)線)。把透明膠片隨機(jī)(盲法)置放在睪丸網(wǎng)圖像上，讓測(cè)線跨過(guò)整個(gè)睪丸網(wǎng)分布區(qū)域，且測(cè)線方向大致垂直于睪丸網(wǎng)的主要分布方向。每當(dāng)測(cè)線與睪丸網(wǎng)的睪丸內(nèi)側(cè)腔面或睪丸網(wǎng)瓣膜的被膜側(cè)腔面形成一個(gè)交點(diǎn)，就測(cè)量一個(gè)睪丸網(wǎng)寬度——從交點(diǎn)至睪丸網(wǎng)被膜側(cè)腔面的最近距離(圖1);每當(dāng)測(cè)線與睪丸網(wǎng)的睪丸內(nèi)側(cè)腔面形成一個(gè)交點(diǎn)，就測(cè)量一個(gè)睪丸網(wǎng)生精小管間距——從交點(diǎn)至生精小管基底面的最近距離(圖1)。用刻度為0.5 mm 的不銹鋼直尺測(cè)量這些距離，把測(cè)量結(jié)果分組記為0.25 mm、0.75 mm、1.25 mm……在4 幅睪丸網(wǎng)圖像上實(shí)際測(cè)得的睪丸網(wǎng)寬度個(gè)數(shù)少于10(為5 ～8)，因此再隨機(jī)疊加一次測(cè)線后對(duì)這4 幅圖像再測(cè)了1 次，結(jié)果取其均值。鑒于本文所用切片是大致垂直于睪丸網(wǎng)被膜側(cè)面的垂直切片，因此本文所測(cè)睪丸網(wǎng)寬度實(shí)際上約等于睪丸網(wǎng)(假設(shè)其為薄膜結(jié)構(gòu))的厚度，所測(cè)睪丸網(wǎng)生精小管間距實(shí)際上相當(dāng)于睪丸網(wǎng)與生精小管之間結(jié)構(gòu)(假設(shè)為薄膜結(jié)構(gòu))的厚度［4］。

2 結(jié)果

睪丸標(biāo)本(包括切片)完好的共30 個(gè)，正常組與脫水組分別為19 和11 個(gè)。在正常組，測(cè)線與睪丸網(wǎng)的睪丸內(nèi)側(cè)腔面、睪丸網(wǎng)瓣膜的被膜側(cè)腔面形成的交點(diǎn)總數(shù)分別為19.8 ±10.1、1.1 ±1.6(x－±s)，與脫水組(結(jié)果分別為19.8 ±8.1、3.0 ±2.9)相比無(wú)顯著性差異。(注:由于測(cè)線大致垂直于睪丸網(wǎng)的睪丸內(nèi)側(cè)腔面或睪丸網(wǎng)瓣膜的被膜側(cè)腔面，這兩種交點(diǎn)數(shù)乘以測(cè)線間距5 mm 即分別為睪丸網(wǎng)的睪丸內(nèi)側(cè)面、睪丸網(wǎng)瓣膜總高度的近似估計(jì)。)脫水組的后1 種交點(diǎn)數(shù)結(jié)果(相當(dāng)于瓣膜高度)雖比正常組大3 倍左右，但由于變異大，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(秩和檢驗(yàn)的P 值為0.06)。

正常組睪丸網(wǎng)的平均寬度約為93 μm，脫水組的該寬度與之差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。正常組睪丸網(wǎng)生精小管間距約為38 μm，在脫水組該間距顯著減少約70%(表1)。

根據(jù)顯微鏡下的定性或半定量分析，只有脫水組的3 個(gè)動(dòng)物在整個(gè)睪丸網(wǎng)腔內(nèi)可見(jiàn)20 ～40 個(gè)精子，其余動(dòng)物的睪丸網(wǎng)腔內(nèi)均幾乎見(jiàn)不到任何精子(表2)。不過(guò)，兩個(gè)組的睪丸網(wǎng)腔內(nèi)均可見(jiàn)較多的球形精子細(xì)胞，且脫水組的球形精子細(xì)胞數(shù)似更多(表2)。

在脫水組，每幅(每個(gè)動(dòng)物)睪丸網(wǎng)圖像上均見(jiàn)睪丸網(wǎng)“擠壓”生精小管的形態(tài)特征，即部分睪丸網(wǎng)突向部分生精小管壁，且該區(qū)域生精小管壁向小管內(nèi)凹陷，在3 幅圖像上甚至可見(jiàn)被“擠壓”生精小管壁變薄(與對(duì)側(cè)小管壁相比);而在正常組，任一睪丸網(wǎng)圖像上均未見(jiàn)這樣的形態(tài)特征(圖1)。

表1 青春期大鼠睪丸網(wǎng)寬度和睪丸網(wǎng)生精小管間距

3 討論

本文研究顯示，青春期雄性SD 大鼠禁水4 ～5 d 后，睪丸網(wǎng)沒(méi)有增寬(與對(duì)照動(dòng)物相比)，但其內(nèi)壓升高，且腔內(nèi)精子與未成熟生精細(xì)胞(球形精子細(xì)胞等)增多。這提示，睪丸網(wǎng)向附睪輸送睪丸內(nèi)產(chǎn)生的精子和未成熟生精細(xì)胞的功能較活躍。正常狀態(tài)下，成年大鼠睪丸網(wǎng)腔內(nèi)［2］或生精小管腔內(nèi)［5］少見(jiàn)精子或長(zhǎng)形精子細(xì)胞，可能是因?yàn)檫@些腔隙窄小，且精子一旦釋放很快就會(huì)被輸送到附睪。在本文中的脫水組，睪丸網(wǎng)腔內(nèi)不僅見(jiàn)較多的精子，也見(jiàn)較多的未成熟生精細(xì)胞，這是因?yàn)槊撍M生精上皮的生精細(xì)胞排列疏松、提前脫落并輸送到附睪［3］。因此，禁水致脫水這種狀態(tài)與高糖高脂血癥所致生精小管和睪丸網(wǎng)改變［1－2］可能大不相同。

之所以推測(cè)脫水組睪丸網(wǎng)內(nèi)壓較高，是因?yàn)椴G丸網(wǎng)與生精小管間距縮短，尤其是睪丸網(wǎng)突向生精小管使生精小管壁凹陷甚至變薄(圖1)。睪丸網(wǎng)內(nèi)壓增高的原因可能不是睪丸網(wǎng)內(nèi)液體(睪丸液)增多(短期禁水致脫水勢(shì)必不會(huì)增加睪丸液的分泌)，而可能是大量(相對(duì)于較小的睪丸網(wǎng)腔隙來(lái)講)未成熟生精細(xì)胞脫落［3］，甚至生精小管周細(xì)胞的收縮較活躍(目前尚無(wú)證據(jù))。至于內(nèi)壓升高為什么沒(méi)引起睪丸網(wǎng)增寬，可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)時(shí)間尚短，且內(nèi)壓增高可能引起睪丸網(wǎng)形狀不規(guī)則(瓣膜傾向于增高就是證據(jù))而不表現(xiàn)為整體增寬。

本文以睪丸后上突出區(qū)域?yàn)橹行那腥〗M織塊，結(jié)果都切到睪丸網(wǎng)，說(shuō)明睪丸網(wǎng)確實(shí)主要分布在睪丸后上區(qū)域［2］。不過(guò)，肉眼切取組織塊時(shí)，我們實(shí)際上看不到睪丸網(wǎng)的中心或出口處，因此這可能增加睪丸網(wǎng)寬度的組織塊間(器官內(nèi))變異，進(jìn)而增加最后結(jié)果的總變異(表1，其中的標(biāo)準(zhǔn)差結(jié)果較大)。

采用同樣的甲基丙烯酸樹(shù)脂包埋切片，并采用相似的形態(tài)定量方法的研究顯示，正常成年(15.5 ～16.5 周齡)雄性SD 大鼠的睪丸網(wǎng)寬度(厚度)平均為16.3 ±8.3(8.1 ～28.0)μm，本文研究的正常青春期(8 周齡)雄性SD 大鼠的睪丸網(wǎng)寬度(厚度)是這個(gè)結(jié)果的5 倍多。這說(shuō)明隨著精子發(fā)生的成熟、精子數(shù)量的增多，睪丸網(wǎng)會(huì)變得越來(lái)越薄，直至變成一個(gè)狹窄的縫隙而已。注意，睪丸網(wǎng)(成年動(dòng)物［1－2］)雖然狹窄了，但通過(guò)它輸送的精子顯然要多得多(與本文的青春期動(dòng)物［3］相比)。由此可見(jiàn)，睪丸網(wǎng)的寬度實(shí)際上不能有效反映精子輸送是否更多、是否更快。

［1］ 廖 波.高糖高脂血癥對(duì)大鼠睪丸和附睪組織結(jié)構(gòu)的影響的體視學(xué)研究［D］.四川南充:川北醫(yī)學(xué)院，2010

［2］ 廖 波，鄧顯忠，代小思，等.成年SD 大鼠睪丸網(wǎng)的分布［J］.川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，25(3):199 －208

［3］ 朱金釵，郭 洋，向 宇，等.禁水致脫水對(duì)大鼠睪丸內(nèi)精子輸送影響的初步形態(tài)定量研究［J］.川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，28(3):200 －206

［4］ 楊正偉.生物組織形態(tài)定量研究基本工具:實(shí)用體視學(xué)方法［M］.北京:科學(xué)出版社，2012.40 －52，125 －130

［5］ Wen XH，Yang ZW.Quantitative (stereological)study on the spermatozoal storage capacity of epididymis in rats and monkeys［J］.Asian J Androl，2000，2(1):73 －77