宣肺止嗽湯對感染后咳嗽大鼠肺泡灌洗液中細胞因子的影響

王 文,李飛俠,朱 佳

(1.南京中醫(yī)藥大學,南京 210046;2.江蘇省中醫(yī)院,南京 210029)

感染后咳嗽(Post infectious cough,PIC)作為一種獨立性疾病,近年來因發(fā)病率較高而逐漸被醫(yī)學界認識并提出。由于目前對感染后咳嗽發(fā)病機理尚不確定,治療上仍沒有針對性和切實有效的方法”近年來許多醫(yī)家對感染后咳嗽的臨床治療進行了諸多探索及研究,但對中藥治療感染后咳嗽機理仍屬于摸索階段,治療效果尚不能令人滿意。有研究證實[1],細胞因子IL-4、IL-5、IL-8、TNF-a等均與氣道炎癥與氣道高反應性有密切聯(lián)系。本實驗即探討上述細胞因子在咳嗽感染后咳嗽發(fā)生中的作用以及中藥對上述細胞因子影響,從而揭示宣肺止嗽湯作用于感染后咳嗽的可能機制。

1 實驗材料

1.1 動物 健康雄性純白SD大鼠60只,SPF級,體質量180～220 g,由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供,并由江蘇省中醫(yī)藥研究院動物飼養(yǎng)室(清潔Ⅱ級)飼養(yǎng)。

1.2 藥物 宣肺止嗽湯主要組成炙麻黃、牛蒡子、杏仁、紫菀、蟬蛻等,按處方配伍用量配制,購自安徽亳州市華龍中藥飲片廠,浸水 2 h,煮沸再用文火煎40 min,過濾后藥渣再次加水文火煎,重復3次,合并煎煮液,經(jīng)水浴濃縮,使終濃度相當于每1 mL含生藥3.25 g,本湯劑由江蘇省中醫(yī)藥研究院煎藥室煎制;置于4℃冰箱中備用。經(jīng)人與動物劑量換算標準確定大鼠灌胃劑量?；莘茖幱擅绹菔现扑幑旧a(chǎn)(國藥準字H20030054)。

1.3 試劑 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、辣椒素(capsaicin,Cap)均購自美國Sigma公司;RD Rat Interleukin 4(IL-4)Elisa測定試劑盒,RD Rat Interleukin 5(IL-5)Elisa測定試劑盒,RD Rat Interleukin 8(IL-8)Elisa測定試劑盒,RD Rat Tumor Necrosis Factor a(TNF-α)Elisa測定試劑盒均由南京建成生物科技公司提供(進口分裝)。

1.4 儀器 Devilbiss 646型霧化器,購自美國Devilbiss公司,輸出流量為0.037 mL/min,輸出口與雙室透明塑料盒的頭室相連接;PG503-S電子天平,梅特勒公司;Lab systems Finn pipette 100μL單道移液器;Thermo 50μL 8道移液器;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司),華東電子DG5033A酶標儀(南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司)。

2 實驗方法

2.1 感染后咳嗽模型的建立 將50只大鼠置于特制的1 m3的煙室中,以鋸屑末50 g加10支南京牌香煙點燃煙熏,每日熏煙40 min,連續(xù)12 d,自由進食,飲水,每天觀察記錄其癥狀體征變化;第 13、16、19天,用 10%水合氯醛淺麻醉所有大鼠,鼻腔滴入0.4 mg/mL濃度的 LPS 溶液 10 μL/10 g,第 14、15、17、18、20天將大鼠置于透明密閉容器中霧化吸入10-4mol/L的辣椒素溶液3 min,觀察 2min。

2.2 動物分組及給藥治療 模型復制成功后,于實驗的第21天,將50只大鼠隨機分成5組,每組10只。其中A組為模型組,灌服生理鹽水1 mL/100 g,1次/d;B組為宣肺止嗽湯低劑量組,灌服宣肺止嗽湯(低劑量),生藥4.71 g/kg,1次/d(相當于成人劑量的5倍);C組為宣肺止嗽湯中劑量組,灌服宣肺止嗽湯(中劑量),生藥9.42 g/kg,1次/d(相當于成人劑量的10倍);D組為宣肺止嗽湯高劑量組:灌服宣肺止嗽湯(中劑量),生藥14.13 g/kg,1次/d(相當于成人劑量的15倍);E組為陽性對照惠菲寧組:灌服惠菲寧3倍稀釋液 8 mL/kg,1次/d(相當于成人劑量的10倍)。治療2周后處死動物收集標本,所有大鼠均于末次給藥的當天晚上禁食,第2天上午處死。

2.3 標本留取及處理 在灌胃治療2周后,采用脫頸椎法處死大鼠,剪開胸腔,分離出完整的氣管、支氣管和肺組織,結扎右側主支氣管,用接注射器的灌洗器通過左側支氣管向左側肺葉注入0.9%生理鹽水2 mL,進行支氣管肺泡灌洗液(BALF)收集:緩慢注入4℃含生理鹽水2 mL行支氣管肺泡灌洗,緩慢抽吸3次,保留30 s后緩慢回吸,重復3次。所得灌洗液經(jīng)低溫離心(3 000 r/min,4℃,10 min),保留上清液,于-80℃保存以待測。取凍干上清液采用ELISA法測定各組大鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-8、TNF-α水平 (具體測定方法嚴格按照試劑盒說明書進行操作)。

2.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析,全部數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標準差±s),組間比較用t檢驗。

3 實驗結果

從表1、2可以看出,正常組 BALF中 IL-4、IL-5、IL-8、TNF-α較低 ,而模型組 BALF 中 IL-4、IL-5、IL-8、TNF-a明顯增加。宣肺止嗽湯低、中、高劑量組及模型組比較其 IL-4、IL-5、IL-8、TNF-a水平均明顯降低(P<0.01),與空白組比較水平相當(P>0.05),說明宣肺止嗽湯及惠菲寧均可抑制炎癥介質的釋放,且兩者作用相似,其中宣肺止嗽湯的治療效果與藥物劑量無特殊關聯(lián)。

表1 各組大鼠 BALFIL-4、IL-5、IL-8、TNF-α吸光度(OD值)比較±s,n=10)

表1 各組大鼠 BALFIL-4、IL-5、IL-8、TNF-α吸光度(OD值)比較±s,n=10)

注:與空白組比較,△P<0.05;模型組比較,■P<0.05。

組 別 IL-4吸光度 IL-5吸光度 IL-8吸光度 TNF-α吸光度空白組 1.105±0.056 0.793±0.015■ 0.859±0.017 0.889±0.017模型組 1.259±0.039△ 0.948±0.028△ 1.092±0.030△ 1.080±0.049△宣肺止嗽湯低劑組 1.127±0.036■ 0.741±0.020■ 0.828±0.021■ 0.900±0.041■宣肺止嗽湯中劑組 1.082±0.054■ 0.706±0.036■ 0.795±0.027■ 0.812±0.041■宣肺止嗽湯高劑組 1.111±0.050■ 0.805±0.012■ 0.905±0.020■ 0.890±0.009■惠菲寧 1.150±0.058■ 0.801±0.014■ 0.900±0.015■ 0.897±0.045■

表2 各組大鼠BALFIL-4、IL-5、IL-8、TNF-α含量值比較±s,n=10)

表2 各組大鼠BALFIL-4、IL-5、IL-8、TNF-α含量值比較±s,n=10)

注:與空白組比較與,△P<0.05;與模型組比較,■P<0.01。

組 別 NIL-4含量/(pg/L) IL-5含量/(ng/L) IL-8含量/(ng/L) TNF-α含量/(ng/L)空白組 139.94±15.23 108.68±3.01 143.81±3.87 189.34±4.71模型組 196.09±14.35△ 145.32±7.37△ 204.53±8.58△ 245.21±17.58△宣肺止嗽湯低劑組 144.88±10.58■ 97.99±4.02■ 136.50±4.81■ 188.81±12.10■宣肺止嗽湯中劑組 133.80±13.67■ 91.60±7.03■ 129.05±6.31■ 166.37±11.45■宣肺止嗽湯高劑組 141.57±12.96■ 111.08±2.54■ 154.75±4.92■ 189.21±2.24■惠菲寧 149.82±12.79■ 110.44±2.67■ 153.44±3.53■ 193.60±16.12■

4 討論

目前認為氣道炎癥是氣道高反應性的基礎,而細胞因子IL-4為THz細胞所釋放的主要細胞因子,在Th細胞分化過程中,IL-4能調控單核細胞釋放細胞因子,促進THz的發(fā)育分化,誘導THz細胞因子產(chǎn)生,啟動和維持炎癥反應,促進IgE的合成與分泌,并增加炎性細胞的浸潤和活化[2]。IL-5是一種作用于Eos的血源性生長因子,可激活并趨化EOS,上調其黏附分子如CDllb的表達,促進Eos同內(nèi)皮細胞黏附[2]。同時IL-4,IL-5均能刺激肥大細胞增殖,抑制Thl分泌IFN-γ其分泌異常導致IgE過量產(chǎn)生,引起氣道炎癥,誘發(fā)AHR。IL-8是趨化性細胞因子超家族的一員,可趨化和激活中性粒細胞、T淋巴細胞,促進其脫顆粒,產(chǎn)生多種炎性介質,TNF-α這種由巨噬細胞分泌的肽類炎性介質,是氣道強而有力的刺激劑,對中性粒細胞亦有很強的激活作用,可誘導一系列細胞因子的產(chǎn)生,使氣道產(chǎn)生炎性改變,氣道反應性增高[4-5]。這些都表明細胞因子白介素-5、4、8及α-腫瘤壞死因子(TNF-α)與氣道炎癥的形成關系及氣道高反應關系密切。

本研究結果表明,從表1、2可以看出,正常組BALF中 IL-4、IL-5、IL-8、TNF-a 較低 ,而模型組 BALF中 IL-4、IL-5、IL-8、TNF-α明顯增加,說明模型大鼠氣道存在明顯的炎癥反應,釋放大量的細胞因子,參與了氣道高反應。宣肺止嗽湯治療組及惠菲寧組與模型組比較,治療后其 IL-4、IL-5、IL-8、TNF-α水平均明顯降低(P<0.01),與空白組比較水平相當(P>0.05),說明宣肺止嗽湯及惠菲寧均可抑制炎癥介質的釋放,且兩者作用相似,其中宣肺止嗽湯的治療效果與藥物劑量無特殊關聯(lián),但通過測定各組細胞因子平均水平值,宣肺止嗽湯中、低劑量的療效比高劑量組、惠菲寧對照組略好。本實驗說明宣肺止嗽湯可能通過抑制炎癥細胞釋放細胞因子,減輕氣道炎癥,降低氣道高反應,從而有效的治療感染后咳嗽,這為宣肺止嗽湯的臨床應用提供了客觀的實驗依據(jù)。

[1]黃秋芳.小兒感染后咳嗽的發(fā)病機理及治療進展[J].中國藥業(yè),2009,18(15):84-87.

[2]林學顏,張玲.現(xiàn)代細胞與分子免疫學[M].北京:科學出版社,1999:191.

[3]李明華,殷凱生.哮喘病學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1998:79-83.

[4]張慎峰.氣道高反應性的研究進展[J].黑龍江醫(yī)學,2003,27(10):749-750.