中性粒細胞彈性蛋白酶在顱腦損傷大鼠腦組織中的動態(tài)變化

蘇 海 賀學農(nóng) 陳 皓 周昌龍 夏小輝 張 毅 (重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院神經(jīng)外科，重慶 402160)

中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)是一種基質金屬蛋白酶，廣泛存在于中性粒細胞、肥大細胞和巨噬細胞內，在機體的組織損傷、炎癥反應等病理過程中發(fā)揮了重要作用。研究表明NE與腦出血、缺血再灌注等神經(jīng)系統(tǒng)損害有關〔1，2〕，但是NE與顱腦損傷后的繼發(fā)性腦損傷的關系尚未有報道。本研究采用液壓打擊制作顱腦損傷(TBI)大鼠模型，檢測腦組織的NE、血腦屏障(BBB)通透性以及腦組織含水率的動態(tài)變化，探討腦組織NE含量的變化對顱腦損傷后的繼發(fā)性腦水腫的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性健康SD大鼠48只，體重200～250 g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，分為對照組8只和TBI組40 只，其中 TBI組又按6、24、48、72、168 h 時間點分為 5個亞組，每亞組8只大鼠，大鼠適應性喂養(yǎng)3 d，造模后SD大鼠按亞組分籠飼養(yǎng)，正常喂食、喂水。

1.2 TBI模型制作 采用 Thompson〔3〕方式制作模型，用100 g/L水合氯醛(3 ml/kg)經(jīng)腹腔麻醉大鼠，用立體定位儀固定頭部，作頭皮正中切口，剝離骨膜，前囟人字縫尖連線中點偏左4 mm顱骨鉆鉆孔，暴露完整硬腦膜。打擊管內注滿水，與液壓腦創(chuàng)傷打擊裝置連接，造成TBI。

1.3 腦組織NE的測定 對照組和TBI組大鼠分別于相應時間點，經(jīng)水合氯醛麻醉后，快速斷頭取腦，取腦組織精確稱重，置于-70℃保存?zhèn)錅y。測定時將腦組織用生理鹽水在冰浴環(huán)境內以玻璃勻漿器制成10%的腦組織勻漿。采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗夾心法(ELISA)測定。

1.4 BBB通透性的檢測 對照組和TBI組大鼠于預定的時間點用2%偶氮藍(EB)按5 ml/kg經(jīng)股靜脈注入，60 min后，處死大鼠，取大鼠腦組織通過分光光度計定檢測滲出的EB。

1.5 腦含水率測定 對照組和TBI組大鼠在預定時間點，經(jīng)水合氯醛麻醉后，迅速斷頭取腦，將取出的腦組織放在用生理鹽水浸潤過的濾紙上，以防止水分蒸發(fā)。去除軟腦膜和血跡，精密稱重。將腦組織置于95℃恒溫烘箱24 h，再稱取干重。按Blliot公式計算腦含水率=(濕重-干重)/濕重×100%。

2 結果

2.1 TBI大鼠腦組織內NE含量的動態(tài)變化 TBI大鼠腦組織內NE含量在6 h開始增高，24 h進一步升高，48 h達到最高峰，72 h開始逐漸下降，直到168 h仍維持在高水平，TBI組各時間點的腦組織NE含量均高于對照組(P＜0.05)。見表1。

2.2 TBI大鼠腦組織EB含量的動態(tài)變化 腦組織EB含量與NE含量的變化呈同步性，TBI組各時間點的腦組織EB含量均高于對照組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組各時間點腦組織NE、EB含量、腦含水量的比較(x ± s，n=8)

2.3 TBI大鼠腦組織含水率的動態(tài)變化 TBI組大鼠腦組織含水率在6 h開始增高，24、48 h進一步升高，72 h達到最高峰，168 h開始逐漸下降，TBI組各時間點的腦組織含水率均高于對照組(P＜0.01)。見表1。

3 討論

腦水腫是創(chuàng)傷性顱腦損傷后繼發(fā)的主要病理生理改變之一，常影響病情的發(fā)展和轉歸，甚至危及患者的生命。由顱腦創(chuàng)傷導致的腦組織水腫是細胞毒性和血管源性的混合性水腫，并且以細胞毒性腦水腫為主〔4〕。國內外眾多學者對創(chuàng)傷性顱腦損傷后腦水腫進行了深入研究，其病理生理過程，分子生物學機制及愈后評價指標均有較大進展，特別是分子生物學方面進展進一步揭示了TBI繼發(fā)損傷過程。無論是血管源性腦水腫還是細胞毒性腦水腫都離不開炎癥介質的參與〔5〕，其中NE作為創(chuàng)傷后的重要炎性介質，廣泛地參與到創(chuàng)傷后繼發(fā)的病理生理改變過程中。

本研究采用液壓打擊方法制作TBI大鼠模型是一種成熟的TBI模型，操作過程相對比較簡單，模型穩(wěn)定，已經(jīng)廣泛的運用于TBI的各種實驗研究中。EB是一種經(jīng)典的BBB示蹤劑，進入血液后與血清蛋白結合形成EB-白蛋白復合物。正常情況下，這種復合物不能通過BBB，但在顱腦創(chuàng)傷后存在BBB完整性的破壞，EB-白蛋白復合物可以通過破壞的BBB進入腦組織間隙，而EB的滲出量與BBB的破壞程度呈正比。本實驗可以反映BBB破壞程度，間接地反映BBB的通透性〔6〕。NE與BBB屏障通透性變化的同步性說明了NE含量的增加，可能是BBB通透性增高的原因之一。NE是由類溶酶體結構的嗜苯胺藍顆粒釋放的一種絲氨酸蛋白水解酶，NE可以分解周圍蛋白質和破壞組織結構，可以降解彈性蛋白、膠原蛋白、纖維連接蛋白等，纖維連接蛋白受損，則血管通透性增高〔7〕。研究人員通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，外源性NE能夠破壞或分解表面活性物質的主要成分表面活性蛋白SP-A、SP-B、SP-C，導致肺泡表面張力增加，降低肺組織順應性，促進血漿滲漏，引起肺血管內皮和肺泡上皮通透性增高〔8〕。BBB通透性增高是導致創(chuàng)傷性腦水腫的重要原因。本研究發(fā)現(xiàn)TBI大鼠腦組織含水率的變化與NE含量和BBB通透性增高并不完全同步，NE含量增加和BBB通透性增高的高峰期出現(xiàn)在創(chuàng)傷后48 h，而含水率的最高峰發(fā)生在72 h，這種高峰的延遲說明TBI首先引起NE等炎癥介質的含量變化，通常影響B(tài)BB通透性，進一步加重了血管性腦水腫，而NE等炎性介質也可能進一步加重細胞毒性水腫的程度。

本實驗結果提示:實驗性TBI大鼠腦組織內NE含量的升高與腦組織水腫密切相關，NE增加可能是TBI后早期引起B(yǎng)BB通透性增加、血管源性腦水腫形成的重要原因之一。在TBI發(fā)生的過程中，腦組織創(chuàng)傷使腦組織產(chǎn)生炎癥反應，大量中性粒細胞浸潤，激活的中性粒細胞釋放大量的NE，從而降解彈性蛋白、蛋白多糖和膠原，導致組織、細胞和血管基底膜損傷，因此推測NE是引起血管損傷的重要因素之一，是TBI繼發(fā)性腦水腫形成的重要原因，這一發(fā)現(xiàn)可能將為治療TBI后腦水腫開辟一新的途徑。

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4 Marmarou A.Pathophysiology of traumatic brain edema:current concepts〔J〕.Acta Neurochir Suppl，2003;86:7-10.

5 Donkin JJ，Vink R.Mechanisms of cerebral edema in traumatic brain injury:therapeutic developments〔J〕.Curr Opin Neurol，2010;23(3):293-9.

6 胡 俊，丁仕義，黎海濤，血腦屏障開放的檢測方法〔J〕.重慶醫(yī)學雜志，2003;32(12):1774-6.

7 Carden D，Xiao F，Moak C，et al.Neutrophil elastase promotes lung microvascular injury and proteolysis of endothelial cadherins〔J〕.Am J Physiol，1998;275:H385-92.

8 Hagio T，Matsumoto S，Nakao S，et al.Sivelestat，a specific neutrophil elastase inhibitor，prevented phorbolmyristate acetate-induced acute lung injury in conscious rabbits〔J〕.Pulmon Pharmacol Thera p，2005;18:285-91.