混料設(shè)計(jì)法應(yīng)用于多菌種發(fā)酵制備大豆凝膠蛋白

何秋實(shí)

(青島酒店管理職業(yè)技術(shù)學(xué)院，青島 266100)

大豆分離蛋白(SPI)是一種重要植物蛋白產(chǎn)品，不僅具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，而且具有多種功能性質(zhì)，如凝膠性、乳化性、持水性等［1］。凝膠性質(zhì)是大豆蛋白產(chǎn)品在食品中應(yīng)用最重要的功能特性之一，蛋白凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可吸附水分、脂肪、風(fēng)味物質(zhì)、糖及其他成分，因此廣泛應(yīng)用于肉制品、膨化食品和濃縮食品等許多食品當(dāng)中［2］。乳酸菌是人體腸道中的重要微生物，能調(diào)節(jié)人體腸道微生物的菌群平衡，與人體健康息息相關(guān)［3］。如果將混合乳酸菌引入SPI中進(jìn)行發(fā)酵，乳酸菌可以利用單糖發(fā)酵產(chǎn)酸，誘導(dǎo)SPI形成凝膠;同時部分蛋白質(zhì)經(jīng)乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生多肽，有利于改善SPI凝膠的功能性和營養(yǎng)性。國內(nèi)外大多數(shù)文獻(xiàn)都是將乳酸菌用來發(fā)酵乳蛋白，而在SPI中的應(yīng)用研究較少，采用混合菌發(fā)酵SPI的研究更少。

欲尋找混合菌發(fā)酵SPI制備凝膠最佳配方，需進(jìn)行混料設(shè)計(jì)。在混料設(shè)計(jì)中，單純型重心設(shè)計(jì)、單純型格子設(shè)計(jì)和軸設(shè)計(jì)等都是主要的混料設(shè)計(jì)方法［4］?；炝显囼?yàn)設(shè)計(jì)已廣泛應(yīng)用于食品產(chǎn)品的配方試驗(yàn)研究中，特別是各組分間有交互作用的情況下［5－8］。Gobbetti等［9］利用從開菲爾中分離到的菌株進(jìn)行多種比例混合，發(fā)酵牛奶，嘗試用混合菌種代替開菲爾粒。周劍忠等［10］采用混料設(shè)計(jì)研究了發(fā)酵劑中5種菌種的不同組合對發(fā)酵奶風(fēng)味成分的影響，獲得藏靈菇奶純培養(yǎng)發(fā)酵劑的最優(yōu)組合為乳酸乳球菌27%、明串珠菌37%、開菲爾乳桿菌11%、干酪乳桿菌10%、克魯維酵母15%。

本試驗(yàn)采用保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌及其混合菌對大豆分離蛋白進(jìn)行發(fā)酵，應(yīng)用流變儀和質(zhì)構(gòu)儀等手段進(jìn)行分析，比較單一菌和混合菌發(fā)酵產(chǎn)酸性能及對SPI凝膠性質(zhì)的影響，并對混合菌發(fā)酵SPI制備凝膠的發(fā)酵條件和混合菌配比進(jìn)行優(yōu)化。通過試驗(yàn)分析了解其變化規(guī)律，為提高我國大豆蛋白的功能性和應(yīng)用價(jià)值提供一定參考，改善和拓寬SPI在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料

SPI購自哈高科食品有限責(zé)任公司(蛋白質(zhì)含量92.4%)，發(fā)酵菌種(保加利亞乳桿菌L12，嗜熱鏈球菌S1，嗜酸乳桿菌LA2)由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品重點(diǎn)試驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓滅菌鍋:上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;PHS－3C型酸度計(jì):上海鵬順科學(xué)儀器有限公司;精密電動攪拌機(jī):江蘇省金壇市榮華儀器;電熱恒溫水浴鍋:余姚市東方電工儀器廠;恒溫培養(yǎng)箱:北京市永光明醫(yī)療儀器廠;TA－XT2i質(zhì)構(gòu)儀:上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;馬爾文旋轉(zhuǎn)流變儀:天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化

培養(yǎng)基配方(改良MRS液體培養(yǎng)基):5.00 g乙酸鈉，2.00 g 檸檬酸二胺，2.00 g 磷酸氫二鉀，0.25 g硫酸錳，0.10 g 硫酸鎂，5.00 g 蛋白胨，10.00 g 葡萄糖，10.00 g胰蛋白胨，5.00 g 牛肉膏，5.00 g 酵母膏，1.00 g吐溫80，1 000 mL蒸餾水，加熱直到完全溶解。

從冷凍保存菌株的凍存管中取300 μL菌液接入10 mL滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，40℃下靜置培養(yǎng)24 h，然后吸取1.5 mL菌液于50 mL滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，40℃下靜置培養(yǎng)18 h，再吸取3 mL菌液于100 mL滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，40℃下靜置培養(yǎng)16 h作為發(fā)酵種子液。

1.3.2 混合菌發(fā)酵SPI制備凝膠工藝過程

稱取一定量SPI，加水?dāng)嚢枋蛊淙芙猓偬砑悠咸烟?，攪拌水?0 min，得到SPI溶液。60℃殺菌30 min，殺菌后，快速冷卻至室溫。在無菌條件下，將培養(yǎng)好的不同菌種以一定比例接種到已殺菌的SPI溶液中，充分混合。將接種后的溶液放在恒溫培養(yǎng)箱中，恒溫發(fā)酵產(chǎn)凝膠，4℃冷藏12 h。

1.3.3 混合菌發(fā)酵條件的確定

基本發(fā)酵條件:SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，葡萄糖添加量5%，混合菌接種量3%，40℃發(fā)酵5 h。首先在基本發(fā)酵條件下，考察單一菌(保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌)和混合菌(3種菌配比1∶1∶1)的發(fā)酵產(chǎn)酸性能及對SPI凝膠流變性的影響。然后將混合菌接種到SPI溶液中，觀察發(fā)酵狀態(tài)，測定SPI凝膠的強(qiáng)度和持水率。在其他條件不變的情況下，選取SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%，葡萄糖添加量3%、4%、5%、6%、7%，混合菌接種量1%、2%、3%、4%、5%，發(fā)酵溫度36、38、40、42、44 ℃。

1.3.4 混合菌復(fù)配比例的優(yōu)化

試驗(yàn)采用混料設(shè)計(jì)中的單純型重心(Simplex Centroid)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)混料試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，利用Design－Expert軟件中的單純型重心設(shè)計(jì)進(jìn)行過程優(yōu)化，以凝膠強(qiáng)度R1(g)和持水性R2(%)為響應(yīng)值，選擇保加利亞乳桿菌添加量X1(%)、嗜熱鏈球菌添加量X2(%)、嗜酸乳桿菌添加量X3(%)和發(fā)酵時間X4(h)為影響因素，每個因素設(shè)定5個水平進(jìn)行試驗(yàn)，其因素水平編碼表見表1。

表1 因素水平編碼表

1.3.5 pH 和酸度的測定

采用PHS－3C型酸度計(jì)測定樣品溶液pH，在不同發(fā)酵時間測定SPI發(fā)酵液的pH。酸度(°T)采用滴定法進(jìn)行測定［11］。

1.3.6 凝膠流變性的測定

將接菌后的樣品溶液混合均勻，取一定量置于流變儀的承載器中，設(shè)定上下探測平行板距離1 mm，待板間完全充滿樣品溶液，擦去多余溢出的溶液，加上保溫套。先進(jìn)行動態(tài)應(yīng)變掃描，應(yīng)變保持在線性粘彈區(qū)域。然后將溫度調(diào)節(jié)到實(shí)驗(yàn)所需溫度，進(jìn)行時間掃描，掃描頻率為1 Hz，40℃下連續(xù)測定4 h。

1.3.7 凝膠強(qiáng)度的測定

將凝膠樣品置于質(zhì)構(gòu)儀中，采用TPA穿刺法對凝膠強(qiáng)度進(jìn)行測定。測前速度:2.0 mm/s，測中速度:l.0 mm/s，測后速度:2.0 mm/s，測定距離:凝膠厚度的40%，兩次下壓間隔時間:3.0 s，觸發(fā)力:5 g，觸發(fā)類型:自動，探頭類型:P/0.5，每個試驗(yàn)重復(fù)3次。凝膠強(qiáng)度用硬度(Hardness)表示，即探頭下壓過程中的最大感應(yīng)力(單位g)。

1.3.8 持水率的測定

稱取一定質(zhì)量的凝膠體樣品，放入離心管中，然后在轉(zhuǎn)速4 000 r/min下離心20 min，除去上清夜稱重，凝膠持水率按下式計(jì)算:

持水率=m2/m1×100%

式中:m1為離心前凝膠質(zhì)量;m2為吸去水分后凝膠質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸性能及對SPI凝膠流變性的影響

圖1為不同乳酸菌及其混合菌發(fā)酵產(chǎn)酸曲線。由圖1可以看出，不同乳酸菌對SPI發(fā)酵液pH和酸度的影響有所不同，隨著發(fā)酵時間的延長，pH逐漸降低，發(fā)酵酸度均逐漸增大。在發(fā)酵前期，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌產(chǎn)酸速率較快，使SPI發(fā)酵液pH下降的較快，酸度升高的較快;隨著發(fā)酵時間的延長，嗜酸乳桿菌對SPI發(fā)酵液pH和酸度的影響越來越顯著;在發(fā)酵后期，嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌最終的pH和發(fā)酵酸度相近，說明兩者發(fā)酵產(chǎn)酸性能相近。從總體上看，保加利亞乳桿菌和嗜酸乳桿菌對SPI發(fā)酵液pH和酸度的影響較為顯著，且產(chǎn)酸能力強(qiáng)于嗜熱鏈球菌。圖1中混合菌發(fā)酵液的pH低于單一菌發(fā)酵液的pH，而酸度高于單一菌發(fā)酵液，說明混合菌的發(fā)酵產(chǎn)酸性能優(yōu)于單一菌。原因可能由于混合菌相互之間是互利共生的關(guān)系，彼此能夠提供各自生長所需的條件，因此發(fā)酵產(chǎn)酸性能優(yōu)于單一菌。發(fā)酵產(chǎn)酸性能的順序:混合菌＞保加利亞乳桿菌＞嗜酸乳桿菌＞嗜熱鏈球菌。

不同乳酸菌及其混合菌對SPI凝膠流變性的影響見圖2。由圖2可以看出，無論是單一菌還是混合菌發(fā)酵SPI體系，彈性模量G'比黏性模量G″大的很多，即體系呈彈性較大的凝膠態(tài)。單一菌中保加利亞乳桿菌發(fā)酵SPI的 G'最高，其次是嗜酸乳桿菌，最低的是嗜熱鏈球菌，表明保加利亞乳桿菌發(fā)酵SPI體系的凝膠強(qiáng)度最大。原因可能是保加利亞乳桿菌發(fā)酵SPI體系產(chǎn)酸速度較快且pH最低、酸度最高(圖1)，接近SPI等電點(diǎn)(pH 4.5)，在等電點(diǎn)附近由于蛋白質(zhì)分子之間有強(qiáng)的作用力［12］，有利于SPI凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成?；旌暇l(fā)酵SPI體系的G'比單一菌發(fā)酵SPI體系的G'高，表明混合菌發(fā)酵SPI體系的凝膠強(qiáng)度優(yōu)于單一菌發(fā)酵SPI體系。綜合考慮，本試驗(yàn)對混合菌發(fā)酵SPI體系制備凝膠工藝進(jìn)行研究。

2.2 不同發(fā)酵條件對SPI凝膠的影響

如圖3所示，SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)、葡萄糖添加量、接種量和發(fā)酵溫度對混合菌發(fā)酵SPI體系制備凝膠均有影響。

圖3 不同發(fā)酵條件對SPI凝膠強(qiáng)度和持水率的影響

由圖3a和圖3b可知，隨著SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)和葡萄糖添加量的增加，凝膠強(qiáng)度和持水率先逐漸增加，隨后保持平緩。這可能是由于蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高增加了蛋白間及蛋白與多肽間碰撞的概率，從而使凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加緊密，使凝膠強(qiáng)度和持水率增加［13－14］;而蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時，蛋白質(zhì) － 溶劑的相互作用占主導(dǎo)使體系不易形成凝膠［15］。另外，葡萄糖作為乳酸菌的碳源，在一定范圍內(nèi)，葡萄糖添加量會影響乳酸菌的生長，從而影響其發(fā)酵產(chǎn)酸能力以及凝膠強(qiáng)度和持水率。由圖3c和圖3d可知，隨著接種量和發(fā)酵溫度的增加，凝膠強(qiáng)度和持水率先增加后降低。酸致凝膠在pH下降過程中的分子重排是增強(qiáng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，由于高接種量使混合菌發(fā)酵SPI體系的pH下降的過快，沒有足夠的時間發(fā)生分子重排就已到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)［16］，因此過高的接種量使凝膠強(qiáng)度和持水率降低。而發(fā)酵溫度高于菌株的最適生長溫度會影響菌株新陳代謝速率，降低其發(fā)酵能力，使凝膠強(qiáng)度和持水率降低。綜合考慮，選擇SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，葡萄糖添加量5%，混合菌接種量3%，發(fā)酵溫度40℃。

2.3 混合菌最佳配比及發(fā)酵條件的優(yōu)化

以保加利亞乳桿菌添加量X1(%)、嗜熱鏈球菌添加量X2(%)、嗜酸乳桿菌添加量X3(%)、發(fā)酵時間X4(h)分別代表的因素為自變量，以凝膠強(qiáng)度R1(g)和持水率R2(%)為因變量，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理采用統(tǒng)計(jì)軟件Design－Expert來完成，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)安排及結(jié)果

續(xù)表

通過統(tǒng)計(jì)分析軟件Design－Expert進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立凝膠強(qiáng)度回歸模型如下:R1=130.26X1+83.84X2+115.40X3+90.00X4－ 51.30X1X2－213.02X1X3+135.71X1X4－11.25X2X3+71.02X2X4+125.97X3X4+1 081.87X1X2X3－ 191.71X1X2X4+620.48X1X3X4+17.83X2X3X4

采用Design－Expert軟件對凝膠強(qiáng)度模型方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 凝膠硬度回歸方程的方差分析結(jié)果

由表3可知，該模型回歸顯著(P＜0.05)，失擬項(xiàng)不顯著(P＞0.05)，并且該模型 R12=96.8%，R12Adj=92.63%，說明該模型能很好地?cái)M合該試驗(yàn)。通過F值和P值可知X1X2X3之間的交互作用和X1X3X4之間的交互作用對凝膠強(qiáng)度影響顯著，也就是說3種乳酸菌添加量之間的交互作用和保加利亞乳桿菌添加量、嗜酸乳桿菌添加量及發(fā)酵時間3者之間的交互作用對凝膠強(qiáng)度影響顯著。交互作用對凝膠強(qiáng)度的等高線分析見圖4。

通過統(tǒng)計(jì)分析軟件Design－Expert進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立凝膠持水率回歸模型如下:

R2=74.67X1+82.45X2+73.74X3+69.96X4－22.12X1X2－ 27.83X1X3+42.72X1X4－ 4.77X2X3+41.29X2X4+21.72X3X4+144.40X1X2X3+152.74X1X2X4－133.58X1X3X4+128.81X2X3X4

采用Design－Expert軟件對凝膠持水率模型方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 凝膠持水率回歸方程的方差分析結(jié)果

由表4可知，該模型回歸顯著(P＜0.05)，失擬項(xiàng)不顯著(P ＞0.05)，并且該模型 R22=94.34%，R22Adj=86.98%，說明該模型能很好地?cái)M合該試驗(yàn)。通過F值和P值可知X1X2X3之間的交互作用和X1X2X4之間的交互作用對持水率影響顯著，也就是說3種乳酸菌添加量之間的交互作用和保加利亞乳桿菌添加量、嗜熱鏈球菌添加量及發(fā)酵時間3者之間的交互作用對持水率的影響顯著。交互作用對凝膠持水率的等高線分析見圖5。

圖4 混料設(shè)計(jì)因素交互項(xiàng)對凝膠強(qiáng)度的等高線分析

由圖4可以看出，X1(保加利亞乳桿菌添加量)、X2(嗜熱鏈球菌添加量)、X3(嗜酸乳桿菌添加量)、X4(發(fā)酵時間)的交互作用對凝膠強(qiáng)度的影響。當(dāng)發(fā)酵時間固定時，保加利亞乳桿菌和嗜酸乳桿菌以一定比例混合，凝膠強(qiáng)度有較大值;而嗜熱鏈球菌添加量對凝膠強(qiáng)度影響很小。當(dāng)乳酸菌添加量固定時，凝膠強(qiáng)度隨著發(fā)酵時間的延長呈先下降后上升趨勢。

圖5 混料設(shè)計(jì)因素交互項(xiàng)對凝膠持水率的等高線分析

由圖5可以看出，X1(保加利亞乳桿菌添加量)、X2(嗜熱鏈球菌添加量)、X3(嗜酸乳桿菌添加量)、X4(發(fā)酵時間)的交互作用對凝膠持水率的影響。當(dāng)發(fā)酵時間固定時，凝膠持水率隨著嗜熱鏈球菌添加量的增加而顯著增加;當(dāng)3種乳酸菌以一定比例混合時，凝膠持水率有較大值。發(fā)酵時間過長，凝膠持水率反而下降。

圖6為混合菌最佳配比的混料設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果。由圖6可知，當(dāng)混合菌發(fā)酵時間編碼為0.454水平即4.82 h時，無需添加嗜熱鏈球菌，保加利亞乳桿菌添加量與嗜酸乳桿菌添加量水平值配比為42.3∶12.3，即保加利亞乳桿菌添加量1.27%、嗜酸乳桿菌添加量0.37%，凝膠強(qiáng)度有較大值在146.823 g左右。當(dāng)混合菌發(fā)酵時間編碼為0.462水平即4.85 h時，保加利亞乳桿菌添加量、嗜熱鏈球菌添加量與嗜酸乳桿菌添加量水平值配比為 16.04∶33.11∶4.61，即保加利亞乳桿菌添加量0.48%、嗜熱鏈球菌添加量0.99%、嗜酸乳桿菌添加量0.14%，凝膠持水率有較大值在88.49%左右。

圖6 混合菌配比對凝膠強(qiáng)度(a)和持水率(b)的混料設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果

為了驗(yàn)證模型預(yù)測的準(zhǔn)確性，基于單因素試驗(yàn)的結(jié)果，分別按照凝膠強(qiáng)度最大值優(yōu)化的配比和凝膠持水率最大值優(yōu)化的配比重復(fù)5次驗(yàn)證試驗(yàn)取平均值。當(dāng)保加利亞乳桿菌添加量1.27%、嗜酸乳桿菌添加量0.37%，發(fā)酵4.82 h時，凝膠強(qiáng)度平均值為145.98 g與預(yù)測值146.823 g較接近;當(dāng)保加利亞乳桿菌添加量0.48%、嗜熱鏈球菌添加量0.99%、嗜酸乳桿菌添加量0.14%，發(fā)酵4.85 h時，凝膠持水率平均值為87.28%與預(yù)測值88.49%較接近。由于優(yōu)化凝膠強(qiáng)度的發(fā)酵時間(4.82 h)和優(yōu)化凝膠持水率的發(fā)酵時間(4.85 h)非常接近，因此確定發(fā)酵時間為4.8 h，改變混合菌配比就可得到不同性能的SPI凝膠。最終確定混合菌發(fā)酵SPI制備凝膠最優(yōu)工藝為:SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，葡萄糖添加量5%，40℃發(fā)酵4.8 h，4℃冷藏12 h。當(dāng)保加利亞乳桿菌添加量1.27%、嗜酸乳桿菌添加量0.37%時，可得到凝膠強(qiáng)度較大的 SPI凝膠;當(dāng)保加利亞乳桿菌添加量0.48%、嗜熱鏈球菌添加量0.99%、嗜酸乳桿菌添加量0.14%時，可得到持水率較大的SPI凝膠。

3 結(jié)論

不同乳酸菌(保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌)及其混合菌發(fā)酵對SPI體系凝膠性質(zhì)的影響不同，混合菌的發(fā)酵產(chǎn)酸性能最好，并且混合菌發(fā)酵SPI體系的彈性模量G'最高。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用混料設(shè)法對混合菌發(fā)酵SPI制備凝膠的發(fā)酵條件和混合菌配比進(jìn)行優(yōu)化，確定制備SPI凝膠的最佳發(fā)酵條件為:SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，葡萄糖添加量5%，40℃發(fā)酵4.8 h，4℃冷藏12 h。改變保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌3者的配比可得到不同性能的SPI凝膠。當(dāng)保加利亞乳桿菌添加量1.27%、嗜酸乳桿菌添加量0.37%時，可得到高強(qiáng)度的SPI凝膠，最優(yōu)凝膠強(qiáng)度為145.98 g;當(dāng)保加利亞乳桿菌添加量0.48%、嗜熱鏈球菌添加量0.99%、嗜酸乳桿菌添加量0.14%，可得到高持水率的SPI凝膠，最優(yōu)持水率為87.28%。

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