10-羥基喜樹(shù)堿治療小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎

王 燕，魏永鴿，胡曉舟，胡慧華，邢華燕，張 燕，牛 琳，杜 柯

(1鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院，鄭州450052;2鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以對(duì)稱(chēng)性多關(guān)節(jié)炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病。持續(xù)的滑膜炎可導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨和骨的破壞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能受限。目前雖然針對(duì)RA的治療方法較多，如采用免疫抑制劑、激素、細(xì)胞因子拮抗劑、阻斷T-B細(xì)胞接觸的信號(hào)途徑等［1～3］，但療效并不理想，且不良反應(yīng)大，因此，尋找療效好、不良反應(yīng)少的新型治療藥物一直是RA治療領(lǐng)域的熱門(mén)話題。10-羥基喜樹(shù)堿(HCPT)不僅僅可以通過(guò)抑制細(xì)胞增殖而產(chǎn)生較強(qiáng)的抗腫瘤作用，同時(shí)還可以抑制淋巴細(xì)胞活性，減少機(jī)體異常的免疫反應(yīng)，這提示HCPT理論上能控制RA疾病的發(fā)展。因此，本研究采用膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)動(dòng)物模型對(duì)HCPT的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了初步探討。為了研究HCPT在CIA發(fā)病中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，我們通過(guò)對(duì)CIA小鼠的干預(yù)實(shí)驗(yàn)、關(guān)節(jié)炎評(píng)分、CⅡ特異性T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以及小鼠外周淋巴結(jié)T細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子的檢測(cè)來(lái)初步證實(shí)HCPT能否應(yīng)用于RA的預(yù)防治療，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為6～8周的雄性DBA/1小鼠30只。主要試劑:雞源性Ⅱ型膠原蛋白(CⅡ，純度＞99%)購(gòu)于Chondrex公司;Western blot實(shí)驗(yàn)抗體均購(gòu)自 Cell Signaling公司;不完全弗氏佐劑(IFA)和熱滅活結(jié)核分枝桿菌(TB)購(gòu)于DIFCO公司;RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)于Gibco公司。HCPT:5 mL(10mg/支)。

1.2 方法

1.2.1 CIA模型的建立、分組及干預(yù) 將小鼠分為正常對(duì)照組、CIA陽(yáng)性對(duì)照組、HCPT治療組，每組10只。CIA陽(yáng)性對(duì)照組和HCPT治療組每只小鼠經(jīng)尾根部2～3cm處皮下注射100 μL乳化抗原，并在第21天經(jīng)小鼠背部?jī)蓚?cè)皮下注射CⅡ溶液和等量的IFA乳化后的抗原進(jìn)行免疫加強(qiáng)。HCPT治療組從第1天至第20天同時(shí)予HCPT 5mg/(kg·d)，腹腔注射，每日1次;正常對(duì)照組及CIA陽(yáng)性對(duì)照組予相同劑量的生理鹽水，每日1次。

1.2.2 關(guān)節(jié)炎評(píng)分 無(wú)異常變化為0分;踝關(guān)節(jié)有輕微的發(fā)紅和腫脹，或個(gè)別足趾紅或腫為1分;踝關(guān)節(jié)有中度紅斑及腫脹為2分;爪子(包括足趾)出現(xiàn)嚴(yán)重的腫脹和紅斑為3分;多關(guān)節(jié)的重度腫脹和關(guān)節(jié)畸形為4分。關(guān)節(jié)炎評(píng)分為每只小鼠四肢評(píng)分之和。

1.2.3 組織病理學(xué)分析 處死小鼠，分離膝關(guān)節(jié)、固定(10%甲醛)、石蠟包埋、切片，然后進(jìn)行HE染色，并在顯微鏡下觀察病灶炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度，分析各組小鼠的組織病理學(xué)進(jìn)展。

1.2.4 HCPT干預(yù)后CⅡ特異性T細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 行CⅡ特異性T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。取CIA小鼠脾臟制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×106/mL，分別加入0、5、10、20 μg/mL 的 CⅡ刺激，并于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～56 h，然后每孔加入1 μCi的放射性同位素H3-TdR，繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，抽膜、洗板、加入閃爍液后讀取Cpm(微居里)值。

1.2.5 小鼠外周淋巴結(jié)T細(xì)胞亞群檢測(cè) 取發(fā)病高峰期小鼠的淋巴結(jié)制備成單細(xì)胞懸液，加入流式熒光抗體(購(gòu)于BD、eBioscience公司)，通過(guò)胞內(nèi)染色分別標(biāo)記Th1、Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞，從而檢測(cè)各細(xì)胞群的表達(dá)水平。

1.2.6 IFN-γ、IL-17、TGF-β 的檢測(cè) 將各組小鼠脾臟制備成單細(xì)胞懸液(1×107/mL)，每組細(xì)胞懸液中加入20 μg/mL的CⅡ，并于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h收集上清。用 ELISA方法檢測(cè)，由eBioscience公司提供。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，比較行t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組關(guān)節(jié)炎評(píng)分和組織病理學(xué)觀察結(jié)果HCPT治療組關(guān)節(jié)炎評(píng)分明顯低于CIA陽(yáng)性對(duì)照組，尤其在患病高峰期，其評(píng)分遠(yuǎn)低于CIA陽(yáng)性對(duì)照組。組織病理學(xué)分析示HCPT治療組小鼠關(guān)節(jié)的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度遠(yuǎn)小于CIA陽(yáng)性對(duì)照組，且軟骨的破壞亦不如CIA陽(yáng)性對(duì)照組明顯。在初次免疫后45～50 d左右，小鼠的病情均有所緩解，但HCPT治療組小鼠的關(guān)節(jié)炎評(píng)分仍明顯低于CIA陽(yáng)性對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 HCPT干預(yù)后關(guān)節(jié)炎評(píng)分

2.2 各組CⅡ特異性T細(xì)胞增殖能力檢測(cè)結(jié)果HCPT處理后CⅡ特異性T細(xì)胞的增殖明顯受抑(圖2)，在 CⅡ 5、10 及20 μg/mL 時(shí)，HCPT 組 T 細(xì)胞增殖能力均明顯低于CIA陽(yáng)性對(duì)照組，P均＜0.05。正常對(duì)照組、CIA陽(yáng)性對(duì)照組、HCPT治療組的平均 CIA/HCPT比值分別為18.648±1.172/33.45±1.532、18.349±0.946/30.251±0.935、15.553±0.873/27.050±0.676。

2.3 各組小鼠外周淋巴結(jié)T細(xì)胞亞群及IFN-γ、IL-17、TGF-β的檢測(cè)結(jié)果 正常對(duì)照組、CIA陽(yáng)性對(duì)照組、HCPT治療組炎癥細(xì)胞Th1水平分別為0.813±0.073、1.808±0.075、1.055±0.103，Th17分別為1.561±0.112、5.712±0.269、3.806±0.375，Treg細(xì)胞百分比分別為78%、93%、74%，IFN-γ水平分別為830.4±31.479、2130.1±231.275、1630.0±128.949，IL-17水平分別為 80.0±8.124、170.1±12.087、170.1±12.087，TGF-β 水平分別為330.2±14.853、120.5±5.148、299.9±14.828，正常對(duì)照組與CIA陽(yáng)性對(duì)照組及CIA陽(yáng)性對(duì)照組與HCPT治療組比較，P均＜0.05。

圖2 HCPT對(duì)CⅡ特異性T細(xì)胞亞群增殖能力的影響

3 討論

RA是一種常見(jiàn)的致畸性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，全世界約有1%的人患有此病，而我國(guó)人群患病率0.24%～0.40%，各期RA患者超過(guò)500萬(wàn)人。該病臨床表現(xiàn)多樣，患者多在發(fā)病2年內(nèi)即可出現(xiàn)不可逆的骨關(guān)節(jié)破壞，最后將導(dǎo)致關(guān)節(jié)強(qiáng)直、畸形和功能喪失。目前其病因和發(fā)病機(jī)制尚未闡明，據(jù)有關(guān)研究表明，RA發(fā)病與T淋巴細(xì)胞功能密切相關(guān)，而RA的治療長(zhǎng)期以來(lái)主要依靠免疫抑制劑如甲氨蝶吟、來(lái)氟米特、環(huán)孢素A及硫唑嘌呤等［4］，這些藥物雖然在一定程度上可以控制RA的病情進(jìn)展，但其毒副作用較大(如肝腎毒性及骨髓移植等)，因而在很大程度上限制了上述藥物的臨床使用。

近年研究發(fā)現(xiàn)，RA是一種具有增生性和破壞性的類(lèi)似局部性惡性腫瘤的疾病，鑒于此特點(diǎn)，某些抑制腫瘤增殖的藥物有望用于RA的治療。HCPT可通過(guò)抑制細(xì)胞增殖而產(chǎn)生較強(qiáng)的抗腫瘤作用，同時(shí)還可以通過(guò)抑制淋巴細(xì)胞的活性，進(jìn)而抑制機(jī)體的異常免疫反應(yīng)，因此，在理論上HCPT能夠起到控制RA疾病發(fā)展的作用，我們的前期工作亦證實(shí)了這種推測(cè)。所以HCPT有望成為治療RA的新型藥物。但目前尚無(wú)關(guān)于HCPT如何抑制RA滑膜炎癥的報(bào)道，我們?cè)贑IA模型中對(duì)上述機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

CIA模型是一種免疫炎癥模型，其特征是多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，發(fā)病機(jī)制和病理特征與人類(lèi)RA相似，該模型的一個(gè)顯著的特點(diǎn)是T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞對(duì)CII均有過(guò)度應(yīng)答［5］。本研究結(jié)果顯示，HCPT不僅可以明顯推遲CIA小鼠的發(fā)病，而且在發(fā)病過(guò)程中，HCPT治療組小鼠的關(guān)節(jié)炎評(píng)分明顯降低，小鼠關(guān)節(jié)切片中，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的程度亦明顯降低，軟骨破壞程度明顯減輕。從增殖實(shí)驗(yàn)分析，HCPT治療組小鼠CⅡ特異性T細(xì)胞對(duì)CⅡ的反應(yīng)明顯下降。上述結(jié)果提示HCPT可抑制CⅡ特異性T細(xì)胞的反應(yīng)能力。

另外我們還發(fā)現(xiàn)，在CIA發(fā)病初期，滑膜中就可以分離出Th1及Th17細(xì)胞，提示這些細(xì)胞可能是介導(dǎo)炎癥發(fā)生的關(guān)鍵，并且和炎癥的嚴(yán)重程度有關(guān)［6～9］。IL-10 和 TGF-β 主要來(lái)源于 Treg 細(xì)胞，在RA關(guān)節(jié)的滑膜中，Treg細(xì)胞生成明顯減少［10］。研究發(fā)現(xiàn)，RA外周血中Treg雖然可以抑制炎性細(xì)胞增殖，但未抑制IFN-γ及IL-17的產(chǎn)生。通過(guò)檢測(cè)不同組小鼠體內(nèi)Th亞群的變化發(fā)現(xiàn)，HCPT治療組小鼠體內(nèi)Treg細(xì)胞在CD+4T細(xì)胞中的百分比明顯增高，在體外其分泌細(xì)胞因子TGF-β的能力顯著增強(qiáng)，而Th1、Th17細(xì)胞在HCPT治療組中的表達(dá)下降，分泌炎癥因子的能力被抑制。以上結(jié)果均表明，HCPT預(yù)先干預(yù)CIA小鼠可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng)，進(jìn)而降低免疫系統(tǒng)對(duì)CII抗原的敏感性，從而抑制疾病的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，HCPT治療小鼠CIA效果較好，其可通過(guò)抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞增殖，上調(diào)體內(nèi)Treg細(xì)胞并抑制Th1、Th17細(xì)胞的表達(dá)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，有效降低CIA小鼠發(fā)病嚴(yán)重程度，改善關(guān)節(jié)炎癥。本研究為HCPT治療自身免疫性疾病提供了新的理論依據(jù)。

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