• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    結(jié)直腸癌患者DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A、3B基因單核苷酸多態(tài)性觀察

    2013-05-23 07:05:48張國梁
    山東醫(yī)藥 2013年11期
    關(guān)鍵詞:連鎖等位基因甲基化

    徐 峰,張國梁,鄒 江

    (1天津醫(yī)科大學(xué)第一中心臨床學(xué)院,天津300192;2天津市第一中心醫(yī)院)

    大量實(shí)驗(yàn)證明,結(jié)直腸癌(CRC)發(fā)生是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜過程,基因DNA甲基化[1]可能是CRC腫瘤細(xì)胞中抑癌基因失活的機(jī)制之一[2]。催化DNA甲基化的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)主要包括 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和 DNMT3L。DNMT3A和 DNMT3B具有重新甲基化活性[3],據(jù)報(bào)道DNMT3A和DNMT3B基因調(diào)控區(qū)的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點(diǎn)與基因的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。盡管已鑒定出大量的SNPs位點(diǎn),但多局限于單個(gè)位點(diǎn),故對(duì)于與CRC有關(guān)的SNPs研究尚不夠完善。本研究根據(jù)以前研究報(bào)道,采用病例—對(duì)照的分子流行病學(xué)方法,應(yīng)用Sequenom MassArray質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)DNMT3A和DNMT3B的10個(gè)SNPs位點(diǎn)與CRC易感性進(jìn)行了研究?,F(xiàn)報(bào)告如下。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料 觀察組為天津市第一中心醫(yī)院2011年1月~2012年6月確診的89例CRC患者,男46例,女43例;年齡(56.37±15.46)歲,均經(jīng)臨床及病理檢查確診,且臨床資料完整,采集其血液樣本,標(biāo)本采集前均未有放化療或抗腫瘤藥物使用記錄。對(duì)照組為94例健康者,男49例,女45例;年齡(54.63±13.32)歲。兩組性別、年齡等資料均匹配。兩組人群均系天津市漢族人群,個(gè)體之間均無血緣關(guān)系。調(diào)查和取樣均征得受試者本人知情同意,采集外周靜脈血3~4 mL,置于5 mL的 EDTANa2抗凝管中,-80℃凍存。

    1.2 研究方法

    1.2.1 候選基因及SNP的選擇 根據(jù)所查閱的相關(guān)科研文獻(xiàn)報(bào)道,并依據(jù)SNP數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp,dbSNP)中 DNMT3A 和 DNMT3B基因的SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡狀態(tài),選取位于啟動(dòng)子區(qū)域和下游調(diào)控區(qū)的10個(gè)SNPs位點(diǎn),分別為:DNMT3A rs1550117、rs13420827、rs11887120、rs13428812 和 DNMT3B rs6119954、rs4911259、rs4911107、rs1569686、rs2424908、rs2424932。

    1.2.2 DNA提取 用QIAGEN基因組DNA提取試劑盒提取外周血白細(xì)胞基因組DNA,提取步驟參照說明書,采用紫外分光光度計(jì)行DNA水平測(cè)定,并標(biāo)化至質(zhì)量濃度 >25 ng/μL,純度 260/280≥1.7,260/230≥1,樣本量 >20 μL,提取好的 DNA 保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 針對(duì)10個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn),用Sequenom MassArray Designer 3.0軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增及延伸引物,其中特異性擴(kuò)增引物序列見表1。

    表1 擴(kuò)增及延伸引物序列

    1.2.4 基因SNP分型 利用Sequenom MassArray質(zhì)譜陣列技術(shù)(美國,Sequenom公司)對(duì)10個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。方法為:① 多重PCR反應(yīng)擴(kuò)增DNA樣本;②蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase,SAP)反應(yīng),去除未反應(yīng)完的 dNTP;③單堿基延伸反應(yīng)(single base extension,SBE),于SNP位點(diǎn)處延伸上帶有熒光信號(hào)標(biāo)記的單個(gè)堿基;④將所得反應(yīng)產(chǎn)物用樹脂脫鹽后經(jīng)自動(dòng)點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣于384孔板PCR儀(384-element SpectroCHIP array)上;⑤將點(diǎn)制后的芯片用基質(zhì)輔助的激光解吸質(zhì)譜儀(MAIDI-TOF MS)檢測(cè)等位基因,根據(jù)單堿基延伸的等位基因的相對(duì)分子質(zhì)量差異進(jìn)行基因分型;⑥應(yīng)用MassArray Typer軟件分析質(zhì)譜圖。

    1.2.5 SNPs連鎖不平衡分析 采用Haploview4.2軟件對(duì)樣本中的SNPs進(jìn)行連鎖不平衡(link disequilibrium,LD)分析。

    1.2.6 SNPs單體型分析 通過Haploview4.2軟件對(duì)DNMT3A和DNMT3B SNPs行單體型分析。

    1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Plink1.06軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和質(zhì)控,兩組等位基因和基因型頻率行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn),計(jì)算優(yōu)勢(shì)比(OR)及其95%CI[4],采用 Logistic 回歸進(jìn)行矯正。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 兩組基因SNP分型結(jié)果 兩組10個(gè)SNPs位點(diǎn) DNMT3A rs1550117、rs13420827、rs11887120、rs13428812 和 DNMT3B rs6119954、rs4911259、rs4911107、rs1569686、rs2424908、rs2424932 的等位基因分別為 A/G、G/C、C/T、A/G、A/G、T/G、A/G、T/G、C/T、A/G。兩組最小等位基因頻率(MAF)均>1%,且符合Hardy-Weinberg平衡。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明,rs6119954和rs2424908在觀察組與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(rs6119954:OR=0.640,95%CI:0.411~0.996,P=0.047;rs2424908:OR=0.612,95%CI:0.405~0.926,P=0.020)。

    2.2 SNPs連鎖不平衡分析結(jié)果 DNMT3A的4個(gè)位點(diǎn)之間不存在緊密連鎖(r2<0.8),DNMT3B基因構(gòu)建LD顯示有1個(gè)單倍型塊(haplotype Block),由rs6119954、 rs4911259、 rs4911107、 rs1569686、rs2424908、rs2424932組成,兩兩之間存在強(qiáng)連鎖(rs6119954和rs4911259之間的連鎖性稍差,r2=0.83),見圖1。

    圖1 DNMT3A和DNMT3B SNPs LD分析

    2.3 SNPs單體型分析結(jié)果 DNMT3A的4個(gè)位點(diǎn)不存在緊密連鎖,故未檢測(cè)到單體型;DNMT3B的6個(gè)SNP位點(diǎn)間存在緊密連鎖,本實(shí)驗(yàn)檢出4個(gè)單體型,分別為 TGTAGG、CATAGG、CGGGTA 和 CGTAGG,其中觀察組與對(duì)照組TGTAGG單體型頻率分別為86.5%、34.0%;CATAGG單體型頻率分別為40.4%、27.6%,兩組比較,P均<0.05;CGGGTA單體型頻率分別為20.2%、18.6%,CGTAGG單體型頻率分別為2.2%、1.1%,兩組比較,P均 >0.05。

    3 討論

    據(jù)報(bào)道,CRC的發(fā)生、發(fā)展過程中既有原癌基因的激活,又有抑癌基因的失活及突變,包括遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)的改變。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)改變的主要形式,具體過程是指由DNMTs催化,以S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)作為甲基供體,將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶上,生成5'-甲基胞嘧啶(5-mC)的過程[5],這是脊椎動(dòng)物DNA惟一一種自然的共價(jià)修飾方式。DNMT3在腫瘤在發(fā)生、發(fā)展中起重要作用,負(fù)責(zé)基因的重新甲基化。DNMT3A定位于人染色體2p33,DNMT3B定位于人染色體20q11.2。基因調(diào)節(jié)區(qū)CpG島的高甲基化被看作腫瘤抑制基因失活及其他遺傳病發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ),而DNMT3在CpG島的重新甲基化過程中發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)表明,DNMT3A和DNMT3B基因通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)甲基化過程而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,已發(fā)現(xiàn)其在許多腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[6]。最近研究顯示,DNMT3A和DNMT3B基因的單核苷酸多態(tài)性在頭頸部鱗癌、肺腺癌和肺小細(xì)胞癌、大腸腺癌、食管癌、胃癌、腎癌及白血病等多種腫瘤的發(fā)病中具有重要性[7]。

    SNPs是基因組水平上由單個(gè)核苷酸變異引起的一種DNA序列多態(tài)性。由于其數(shù)目眾多、分布廣泛且相對(duì)穩(wěn)定,已被作為第三代基因遺傳標(biāo)志[8]。作為一種穩(wěn)定的遺傳基因早期突變,SNP與疾病有穩(wěn)定的相關(guān)性。因此,通過高密度SNP圖譜,用相關(guān)性分析的方法搜尋某些復(fù)雜遺傳疾病的致病基因,有助于在基因水平了解疾病發(fā)生的機(jī)制。隨著國際人類基因組單體型計(jì)劃(Hapmap)人類遺傳性圖譜的構(gòu)建,SNPs已成為人類基因組研究的重要組成部分。本研究采用的Sequenom MassArray SNP檢測(cè)系統(tǒng),其基本原理為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)。其通過采用高密度SpectroCHIP點(diǎn)陣芯片,按照A、T、G和C的信號(hào)強(qiáng)弱及質(zhì)量差異得出模板序列信息,可高效自動(dòng)化的篩查SNPs,該系統(tǒng)作為一種高通量的檢測(cè)系統(tǒng),適合SNPs的大規(guī)模篩查使用。

    Gowher等[9]研究認(rèn)為,DNMT3A 基因突變和啟動(dòng)子甲基化會(huì)導(dǎo)致基因的mRNA表達(dá)下降亦是基因變異導(dǎo)致癌癥危險(xiǎn)性增加的機(jī)理。Wu等[10]認(rèn)為,DNMT3A基因R822H基因G→A突變后使DNMT3A與ATP的結(jié)合出現(xiàn)位阻,酶的活性(DNA修復(fù)能力)明顯下降,故DNMT3A基因R822H位點(diǎn)突變是導(dǎo)致結(jié)腸癌危險(xiǎn)性的原因。Fan等[11]研究后發(fā)現(xiàn)DNMT3A基因啟動(dòng)子區(qū)域rs1550117與胃癌的易感性緊密相關(guān),可作為預(yù)測(cè)年齡<60歲的個(gè)體對(duì)胃癌易感性的一個(gè)分類標(biāo)志。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)DNMT3A rs13420827位點(diǎn)與卵巢癌的發(fā)生有關(guān)。本研究未能發(fā)現(xiàn)DNMT3A基因rs1550117和rs13420827與CRC相關(guān),提示以上兩個(gè)位點(diǎn)突變可能存在組織器官的差異性。

    本研究發(fā)現(xiàn)散發(fā)CRC患者DNMT3B基因rs1569686位點(diǎn)TT基因型頻率明顯高于普通人群,但值得注意的是,癌癥患者和普通人群的突變率均高于 Hong等[12]的報(bào)道,提示 DNMT3B 基因rs1569686位點(diǎn)存在明顯的種族差異。在以往的研究工作中,DNMT3A和DNMT3B SNP作為風(fēng)險(xiǎn)因素來衡量人群腫瘤的易感性,多局限于單個(gè)位點(diǎn),而在本研究中,通過前期應(yīng)用全基因組關(guān)聯(lián)研究中國漢族人群的CRC發(fā)病情況,結(jié)合查閱的相關(guān)科研文獻(xiàn),對(duì)發(fā)現(xiàn)的10個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行研究,結(jié)果提示DNMT3B的2個(gè)SNP位點(diǎn)rs6119954和rs2424908多態(tài)性與漢族人群CRC發(fā)病相關(guān),這在中國漢族人群是首次報(bào)道,在其他人種亦未見報(bào)道。Hu等[13]研究證明rs1569686的TT等位基因型比其他基因型胃癌的發(fā)生率低。鮑倩等[14]通過對(duì)DNMT3B基因啟動(dòng)子區(qū)rs1569686的檢測(cè),證實(shí)rs1569686位點(diǎn)G等位基因在CRC發(fā)生過程中是一個(gè)潛在保護(hù)因素。

    連鎖不平衡研究是尋找疾病相關(guān)基因易感位點(diǎn)的手段之一,單體型分析是其不可缺少的工作,利用配對(duì)連鎖不平衡構(gòu)建單體型塊在全基因組范圍內(nèi)作圖是目前人類基因組研究的重要內(nèi)容之一[15]。我們采用基于最大期望算法(Expectation-Maximization,EM)的Haploview4.2軟件,根據(jù)等位基因頻率決定散發(fā)群體中雜合子個(gè)體的單倍型分布,得出的群體單體型頻率較接近真實(shí)情況。在本實(shí)驗(yàn)中,配對(duì)連鎖不平衡檢驗(yàn)表明,DNMT3A的4個(gè)位點(diǎn)連鎖不平衡程度較低,而DNMT3B的6個(gè)位點(diǎn)間存在強(qiáng)連鎖,除rs6119954和rs4911259之間連鎖性稍差(r2=0.83)外的其他位點(diǎn)之間接近或達(dá)到了完全的連鎖不平衡。因此,在實(shí)際應(yīng)用中,達(dá)到完全連鎖不平衡的位點(diǎn)之中選擇其一即可代表其他位點(diǎn)的等位基因型。而且,此6個(gè)位點(diǎn)歸屬于一個(gè)單體型塊,能否在他們中篩選出單體型標(biāo)簽SNP(haplotype tag SNP,htSNP),并探討與疾病的關(guān)系是我們今后的研究重點(diǎn)。

    將來的研究可能是進(jìn)一步驗(yàn)證DNMT3A和DNMT3B基因位點(diǎn)與CRC的關(guān)系,如使用基因敲入技術(shù)使小鼠表達(dá)DNMT3A和DNMT3B基因位點(diǎn)突變蛋白,然后觀察小鼠CRC的發(fā)生率。而結(jié)腸癌作為多基因異常疾病,分析其他甲基轉(zhuǎn)移酶遺傳異常的連鎖不平衡關(guān)系亦非常重要。因此,CRC發(fā)病的危險(xiǎn)因素還有待于進(jìn)一步研究,以利于更全面的闡述人群CRC的發(fā)病機(jī)制。

    [1]Eng C,Herman JG,Baylin SB,et al.A bird's eye view of global methylation[J].Nat Getet,2000,24(2):101-102.

    [2]Esteller M.Epigenetics provides a new generation of oncogenes and tumour-suppressor genes[J].Br J Cancer,2006,94(2):179-183.

    [3]Liu K,Wang YF,Cantemir C,et al.Endogenous assays of DNA methyltransferases:evidence for differential activities of DNMT1,DNMT2,and DNMT3 in mammalian cells in vivo[J].Mol Cell Biol,2003,23(8):2709-2719.

    [4]Purcell S,Neale B,Todd-Brown K,et al.PLINK:a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses[J].Am J Hum Genet,2007,81(3):559-575.

    [5]張永彪,褚嘉祐.表觀遺傳學(xué)與人類疾病的研究進(jìn)展[J].遺傳,2005,27(3):466-472.

    [6]Schmidt WM,Sedivy R,F(xiàn)orstner B,et al.Progressive up-regulation of genes encoding DNA methyltransferase in the colorectal adenoma-carcinoma sequence[J].Mol Carcing,2007,46(9):766-772.

    [7]Chang KP,Hao SP,Liu CT,et al.Promoter polymorphisms of DNMT3B and the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Taiwan:a case-control study[J].Oral Oncol,2007,43(4):345-351.

    [8]Divne AM,Allen M.A DNA micro-array system for forensic SNP analysis[J].Forensic Sci Int,2005,154(2-3):111-121.

    [9]Gowher H,Loutchanwoot P,Vorobjeva O,et al.Mutational analysis of the catalytic domai-n of the murine Dnmt3a DNA-(cytosine C5)-methyltransferase[J].J Mol Biol,2006,357(3):928-941.

    [10]Wu H,Coskun V,Tao J,et al.DNMT3a-dependent nonpromoter DNA methylation facilitates transcription of neurogenic genes[J].Science,2010,329(5990):444-448.

    [11]Fan H,Liu D,Qiu X,et al.A functional polymorphism in the DNA methyltransferase-3A promoter modifies the susceptibility in gastric cancer but not in esophageal carcinoma[J].BMC Med,2010,(8):12.

    [12]Hong YS,Lee HJ,You CH,et al.DNMT3B 39179GT polymorphism and the risk of ad-enocarcinoma of the colon in Koreans[J].Biochem Genet,2007,45(3-4):155-163.

    [13]Hu J,F(xiàn)an H,Liu D,et al.DNMT3B promoter polymorphism and risk of gastric cancer[J].Dig Dis Sci,2010,55(4):1011-1016.

    [14]鮑倩,何幫順,陳麗萍,等.DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B基因啟動(dòng)子單核苷酸多態(tài)性與結(jié)直腸癌的相關(guān)性[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2012,46(1):53-57.

    [15]Lai E,Bowman C,Bansal A,et al.Medical application of haplotype-based SNP maps:learning to walk before we run[J].Nat Genet,2002,32(3):353.

    猜你喜歡
    連鎖等位基因甲基化
    親子鑒定中男性個(gè)體Amelogenin基因座異常1例
    智慧健康(2021年17期)2021-07-30 14:38:32
    專注零售連鎖空間打造
    庫里受傷的連鎖效應(yīng)
    NBA特刊(2018年7期)2018-06-08 05:48:32
    布拉格Burrito Loco連鎖快餐店
    WHOHLA命名委員會(huì)命名的新等位基因HLA-A*24∶327序列分析及確認(rèn)
    DXS101基因座稀有等位基因的確認(rèn)1例
    有壹手——重新定義快修連鎖
    鼻咽癌組織中SYK基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化分析
    胃癌DNA甲基化研究進(jìn)展
    基因組DNA甲基化及組蛋白甲基化
    遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:58:49
    免费播放大片免费观看视频在线观看| 免费大片18禁| 亚洲精品日本国产第一区| av线在线观看网站| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲精品aⅴ在线观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲第一av免费看| 全区人妻精品视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| av女优亚洲男人天堂| 午夜福利视频在线观看免费| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲av福利一区| 最后的刺客免费高清国语| 纯流量卡能插随身wifi吗| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 一级,二级,三级黄色视频| 欧美精品国产亚洲| 日韩亚洲欧美综合| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产成人精品无人区| 十分钟在线观看高清视频www| 久久韩国三级中文字幕| 中文字幕亚洲精品专区| 老司机影院成人| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 丝袜美足系列| 国产精品女同一区二区软件| 少妇丰满av| av免费观看日本| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 五月开心婷婷网| av线在线观看网站| 国产精品人妻久久久久久| av.在线天堂| 亚洲av.av天堂| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 三上悠亚av全集在线观看| 99国产精品免费福利视频| 永久免费av网站大全| 日韩大片免费观看网站| 乱码一卡2卡4卡精品| 高清在线视频一区二区三区| 不卡视频在线观看欧美| 国产精品一国产av| 国产高清有码在线观看视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 黄色一级大片看看| 日韩中字成人| 丰满少妇做爰视频| 高清在线视频一区二区三区| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产亚洲欧美精品永久| 青春草国产在线视频| 国产精品国产av在线观看| 久久久亚洲精品成人影院| 一级片'在线观看视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 91成人精品电影| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲国产av影院在线观看| 大片免费播放器 马上看| 内地一区二区视频在线| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 麻豆成人av视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久青草综合色| 免费观看的影片在线观看| 91精品国产九色| 日韩一区二区视频免费看| 欧美激情国产日韩精品一区| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| av又黄又爽大尺度在线免费看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产精品欧美亚洲77777| 成人漫画全彩无遮挡| 成人漫画全彩无遮挡| 夫妻午夜视频| 国产片内射在线| 日本av手机在线免费观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 91久久精品国产一区二区成人| 婷婷色综合www| 亚洲人与动物交配视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 中文字幕久久专区| 看免费成人av毛片| 亚洲精品视频女| 色婷婷av一区二区三区视频| 黄片播放在线免费| 春色校园在线视频观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 少妇精品久久久久久久| 国产精品99久久久久久久久| 国产成人精品久久久久久| 最新中文字幕久久久久| 在线观看国产h片| 一区二区三区免费毛片| 久久精品久久久久久久性| h视频一区二区三区| 天天影视国产精品| 中国三级夫妇交换| 成人无遮挡网站| 久久久久久久国产电影| 日韩视频在线欧美| 亚洲第一区二区三区不卡| 久久精品国产自在天天线| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 插阴视频在线观看视频| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲精品一二三| freevideosex欧美| 色哟哟·www| 国产高清有码在线观看视频| 国产精品欧美亚洲77777| 视频在线观看一区二区三区| 大码成人一级视频| 久久午夜福利片| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 在线观看免费视频网站a站| 国产精品久久久久久久电影| 中文欧美无线码| 精品久久国产蜜桃| av在线播放精品| 中文字幕制服av| 久久亚洲国产成人精品v| av网站免费在线观看视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 五月开心婷婷网| 国产精品一国产av| 亚洲综合色网址| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 日韩在线高清观看一区二区三区| 91国产中文字幕| 日本爱情动作片www.在线观看| 一本一本综合久久| 久久精品夜色国产| 一级毛片aaaaaa免费看小| 三级国产精品欧美在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲精品一区蜜桃| 国产成人精品在线电影| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 日韩av免费高清视频| 午夜免费鲁丝| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 新久久久久国产一级毛片| 尾随美女入室| av播播在线观看一区| 制服人妻中文乱码| 校园人妻丝袜中文字幕| 午夜福利视频精品| 另类精品久久| 伊人久久精品亚洲午夜| 少妇丰满av| 最后的刺客免费高清国语| 国产日韩欧美亚洲二区| 欧美激情国产日韩精品一区| av免费观看日本| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 热re99久久精品国产66热6| 精品一区二区三卡| 交换朋友夫妻互换小说| 日本vs欧美在线观看视频| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲五月色婷婷综合| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 欧美+日韩+精品| 美女主播在线视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 99热这里只有精品一区| 国产男女超爽视频在线观看| 久久久久久久久大av| 好男人视频免费观看在线| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产有黄有色有爽视频| 大片电影免费在线观看免费| 九色亚洲精品在线播放| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产精品久久久久久久电影| 日韩伦理黄色片| 亚洲精品av麻豆狂野| 中文字幕制服av| 亚洲中文av在线| 久久热精品热| av免费在线看不卡| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 新久久久久国产一级毛片| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 欧美bdsm另类| 夫妻午夜视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲成人av在线免费| 国产精品一国产av| 国产片内射在线| 国产成人aa在线观看| 大香蕉久久网| 国产精品女同一区二区软件| h视频一区二区三区| 最新中文字幕久久久久| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 欧美最新免费一区二区三区| 黄片播放在线免费| 国产av一区二区精品久久| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产乱来视频区| 国产男女超爽视频在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 日韩视频在线欧美| 亚洲av男天堂| 国产爽快片一区二区三区| 两个人的视频大全免费| 久久午夜福利片| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲av男天堂| 国产爽快片一区二区三区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产精品久久久久久av不卡| 一个人看视频在线观看www免费| 亚州av有码| 婷婷成人精品国产| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲国产av新网站| 免费观看无遮挡的男女| 在线观看www视频免费| 熟女av电影| 国产永久视频网站| 国产精品人妻久久久影院| 人妻少妇偷人精品九色| 欧美最新免费一区二区三区| 观看美女的网站| 夜夜爽夜夜爽视频| 精品一区二区免费观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 欧美日韩成人在线一区二区| 男人爽女人下面视频在线观看| www.av在线官网国产| 国产精品三级大全| 免费黄频网站在线观看国产| 草草在线视频免费看| 99热6这里只有精品| 国产高清不卡午夜福利| 国精品久久久久久国模美| 秋霞伦理黄片| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 成人毛片a级毛片在线播放| 国精品久久久久久国模美| 另类亚洲欧美激情| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 日韩人妻高清精品专区| 曰老女人黄片| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 欧美人与善性xxx| 男女边吃奶边做爰视频| 精品视频人人做人人爽| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 极品少妇高潮喷水抽搐| 最黄视频免费看| 久久精品夜色国产| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 2018国产大陆天天弄谢| 日本欧美视频一区| 亚洲精品乱久久久久久| 国产在线一区二区三区精| 亚洲熟女精品中文字幕| 啦啦啦啦在线视频资源| 午夜日本视频在线| 欧美日韩av久久| 大陆偷拍与自拍| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产精品国产av在线观看| 精品久久蜜臀av无| 新久久久久国产一级毛片| 美女主播在线视频| 欧美 日韩 精品 国产| 18在线观看网站| 亚洲国产色片| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产精品久久久久久av不卡| 性高湖久久久久久久久免费观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 蜜桃在线观看..| 大片电影免费在线观看免费| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲国产av新网站| 老熟女久久久| 日韩精品有码人妻一区| 欧美日韩亚洲高清精品| 精品久久久久久久久亚洲| 秋霞在线观看毛片| 亚洲精品自拍成人| 九色亚洲精品在线播放| a级毛片在线看网站| 亚洲四区av| 成人亚洲欧美一区二区av| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲,欧美,日韩| 国产视频首页在线观看| 考比视频在线观看| 激情五月婷婷亚洲| 国产成人午夜福利电影在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久午夜综合久久蜜桃| 久热这里只有精品99| 亚洲精品乱久久久久久| av黄色大香蕉| 少妇人妻久久综合中文| 久久久久久久久久久丰满| 五月伊人婷婷丁香| 三上悠亚av全集在线观看| 午夜av观看不卡| 韩国av在线不卡| 久久久久久久久久久久大奶| 老司机影院成人| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 一本大道久久a久久精品| 色网站视频免费| 亚洲高清免费不卡视频| 大陆偷拍与自拍| 丝袜美足系列| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 高清不卡的av网站| 欧美人与善性xxx| 18禁在线播放成人免费| 午夜福利,免费看| 久久ye,这里只有精品| 日韩欧美一区视频在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 成人综合一区亚洲| 国产亚洲欧美精品永久| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 日韩强制内射视频| 热99久久久久精品小说推荐| 欧美性感艳星| 免费看光身美女| 色视频在线一区二区三区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 人人澡人人妻人| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 9色porny在线观看| 国产探花极品一区二区| 91久久精品国产一区二区成人| 黄色配什么色好看| 精品少妇内射三级| 黑丝袜美女国产一区| 99九九在线精品视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 免费观看无遮挡的男女| 免费av不卡在线播放| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日韩免费高清中文字幕av| 熟女电影av网| 久久久久网色| 日韩一本色道免费dvd| 婷婷色综合www| 午夜免费男女啪啪视频观看| 观看av在线不卡| 午夜福利视频精品| 在线观看免费视频网站a站| 街头女战士在线观看网站| 国产成人免费无遮挡视频| 精品人妻在线不人妻| 一区在线观看完整版| 亚洲精品日本国产第一区| 伦理电影大哥的女人| 亚州av有码| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| a级毛片在线看网站| 能在线免费看毛片的网站| 91精品一卡2卡3卡4卡| 97超视频在线观看视频| 亚洲av综合色区一区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 日韩成人av中文字幕在线观看| 日本91视频免费播放| 国产精品成人在线| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 亚洲av二区三区四区| 久久久精品94久久精品| 少妇精品久久久久久久| 人人妻人人澡人人看| 欧美日韩亚洲高清精品| 免费人妻精品一区二区三区视频| 日韩亚洲欧美综合| 精品人妻偷拍中文字幕| 97精品久久久久久久久久精品| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 人妻系列 视频| 国产一区二区三区av在线| 欧美 日韩 精品 国产| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 青青草视频在线视频观看| 成年人免费黄色播放视频| av卡一久久| 色网站视频免费| 99久国产av精品国产电影| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 韩国高清视频一区二区三区| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲人成网站在线播| 日日撸夜夜添| h视频一区二区三区| 搡老乐熟女国产| 国产在线视频一区二区| 丰满少妇做爰视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 免费黄色在线免费观看| 国产 一区精品| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 在现免费观看毛片| 国产黄色免费在线视频| 三上悠亚av全集在线观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产视频首页在线观看| 国产成人精品福利久久| 2021少妇久久久久久久久久久| 人妻夜夜爽99麻豆av| 欧美xxxx性猛交bbbb| 欧美日韩在线观看h| 18禁观看日本| 在线观看三级黄色| 久久毛片免费看一区二区三区| 综合色丁香网| 最近中文字幕2019免费版| 精品一区二区三区视频在线| 成人手机av| 中文字幕亚洲精品专区| 日韩中文字幕视频在线看片| 欧美变态另类bdsm刘玥| 中文字幕av电影在线播放| 在线天堂最新版资源| 午夜激情av网站| 国产精品无大码| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲国产av新网站| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产探花极品一区二区| 最后的刺客免费高清国语| 久久女婷五月综合色啪小说| 特大巨黑吊av在线直播| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲精品一二三| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 欧美最新免费一区二区三区| 人妻少妇偷人精品九色| 日本午夜av视频| 亚洲国产精品国产精品| 高清av免费在线| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 精品少妇内射三级| 我的老师免费观看完整版| 亚洲精品成人av观看孕妇| 3wmmmm亚洲av在线观看| 少妇精品久久久久久久| 久久影院123| 成人亚洲精品一区在线观看| 在线 av 中文字幕| 国产精品一国产av| 日本91视频免费播放| a级毛片免费高清观看在线播放| 久久久久久久久久成人| 99九九在线精品视频| 美女大奶头黄色视频| 成人二区视频| 各种免费的搞黄视频| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 最近手机中文字幕大全| 男女边摸边吃奶| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产男人的电影天堂91| av视频免费观看在线观看| 免费观看性生交大片5| 人体艺术视频欧美日本| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产日韩欧美在线精品| 天堂8中文在线网| 亚洲成色77777| 人妻少妇偷人精品九色| 少妇丰满av| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 日韩成人av中文字幕在线观看| 欧美日韩av久久| 日本色播在线视频| 久久久国产欧美日韩av| 99九九线精品视频在线观看视频| 99视频精品全部免费 在线| 久久精品夜色国产| 国产伦精品一区二区三区视频9| 老女人水多毛片| 亚洲国产精品一区三区| 高清午夜精品一区二区三区| 久久久久国产精品人妻一区二区| 久久精品国产自在天天线| 欧美97在线视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久久久久伊人网av| kizo精华| 人妻人人澡人人爽人人| 国产精品偷伦视频观看了| 精品亚洲成a人片在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 精品国产露脸久久av麻豆| 国产精品国产三级国产专区5o| 色婷婷av一区二区三区视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 精品国产国语对白av| 日韩一本色道免费dvd| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲成色77777| 少妇人妻精品综合一区二区| 少妇人妻久久综合中文| a级片在线免费高清观看视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 少妇高潮的动态图| 中文字幕最新亚洲高清| 国内精品宾馆在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 2021少妇久久久久久久久久久| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产精品女同一区二区软件| 中国美白少妇内射xxxbb| 丰满迷人的少妇在线观看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 黄色怎么调成土黄色| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国模一区二区三区四区视频| 天堂中文最新版在线下载| 丰满少妇做爰视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 天美传媒精品一区二区| 欧美日本中文国产一区发布| 国产成人av激情在线播放 | 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产精品久久久久成人av| 国产成人精品在线电影| 最后的刺客免费高清国语| 久久鲁丝午夜福利片| 一级毛片电影观看| 99国产精品免费福利视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产 精品1| 日本与韩国留学比较| 韩国高清视频一区二区三区| 哪个播放器可以免费观看大片| 18禁动态无遮挡网站| 久久久久久伊人网av| 国产日韩欧美在线精品| 国产精品免费大片| 国产又色又爽无遮挡免| 久久久精品94久久精品| 亚洲欧美成人精品一区二区| 91在线精品国自产拍蜜月| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 一本久久精品| 日韩人妻高清精品专区| 国产精品久久久久久精品古装| 人人妻人人澡人人看| 国产成人精品一,二区| 激情五月婷婷亚洲| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲国产色片| av播播在线观看一区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 天堂8中文在线网| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 只有这里有精品99| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲精品一二三| av卡一久久| 午夜福利网站1000一区二区三区| 青春草国产在线视频| 精品国产一区二区久久| 青春草视频在线免费观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 久久久久久久久久久免费av| 五月天丁香电影| 免费高清在线观看视频在线观看| 在线观看一区二区三区激情|