結(jié)直腸癌患者DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A、3B基因單核苷酸多態(tài)性觀察

徐 峰，張國梁，鄒 江

(1天津醫(yī)科大學(xué)第一中心臨床學(xué)院，天津300192;2天津市第一中心醫(yī)院)

大量實(shí)驗(yàn)證明，結(jié)直腸癌(CRC)發(fā)生是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜過程，基因DNA甲基化［1］可能是CRC腫瘤細(xì)胞中抑癌基因失活的機(jī)制之一［2］。催化DNA甲基化的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)主要包括 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和 DNMT3L。DNMT3A和 DNMT3B具有重新甲基化活性［3］，據(jù)報(bào)道DNMT3A和DNMT3B基因調(diào)控區(qū)的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點(diǎn)與基因的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。盡管已鑒定出大量的SNPs位點(diǎn)，但多局限于單個(gè)位點(diǎn)，故對(duì)于與CRC有關(guān)的SNPs研究尚不夠完善。本研究根據(jù)以前研究報(bào)道，采用病例—對(duì)照的分子流行病學(xué)方法，應(yīng)用Sequenom MassArray質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)DNMT3A和DNMT3B的10個(gè)SNPs位點(diǎn)與CRC易感性進(jìn)行了研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 觀察組為天津市第一中心醫(yī)院2011年1月～2012年6月確診的89例CRC患者，男46例，女43例;年齡(56.37±15.46)歲，均經(jīng)臨床及病理檢查確診，且臨床資料完整，采集其血液樣本，標(biāo)本采集前均未有放化療或抗腫瘤藥物使用記錄。對(duì)照組為94例健康者，男49例，女45例;年齡(54.63±13.32)歲。兩組性別、年齡等資料均匹配。兩組人群均系天津市漢族人群，個(gè)體之間均無血緣關(guān)系。調(diào)查和取樣均征得受試者本人知情同意，采集外周靜脈血3～4 mL，置于5 mL的 EDTANa2抗凝管中，-80℃凍存。

1.2 研究方法

1.2.1 候選基因及SNP的選擇 根據(jù)所查閱的相關(guān)科研文獻(xiàn)報(bào)道，并依據(jù)SNP數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp，dbSNP)中 DNMT3A 和 DNMT3B基因的SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡狀態(tài)，選取位于啟動(dòng)子區(qū)域和下游調(diào)控區(qū)的10個(gè)SNPs位點(diǎn)，分別為:DNMT3A rs1550117、rs13420827、rs11887120、rs13428812 和 DNMT3B rs6119954、rs4911259、rs4911107、rs1569686、rs2424908、rs2424932。

1.2.2 DNA提取 用QIAGEN基因組DNA提取試劑盒提取外周血白細(xì)胞基因組DNA，提取步驟參照說明書，采用紫外分光光度計(jì)行DNA水平測(cè)定，并標(biāo)化至質(zhì)量濃度 ＞25 ng/μL，純度 260/280≥1.7，260/230≥1，樣本量 ＞20 μL，提取好的 DNA 保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 針對(duì)10個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，用Sequenom MassArray Designer 3.0軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增及延伸引物，其中特異性擴(kuò)增引物序列見表1。

表1 擴(kuò)增及延伸引物序列

1.2.4 基因SNP分型 利用Sequenom MassArray質(zhì)譜陣列技術(shù)(美國，Sequenom公司)對(duì)10個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。方法為:① 多重PCR反應(yīng)擴(kuò)增DNA樣本;②蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP)反應(yīng)，去除未反應(yīng)完的 dNTP;③單堿基延伸反應(yīng)(single base extension，SBE)，于SNP位點(diǎn)處延伸上帶有熒光信號(hào)標(biāo)記的單個(gè)堿基;④將所得反應(yīng)產(chǎn)物用樹脂脫鹽后經(jīng)自動(dòng)點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣于384孔板PCR儀(384-element SpectroCHIP array)上;⑤將點(diǎn)制后的芯片用基質(zhì)輔助的激光解吸質(zhì)譜儀(MAIDI-TOF MS)檢測(cè)等位基因，根據(jù)單堿基延伸的等位基因的相對(duì)分子質(zhì)量差異進(jìn)行基因分型;⑥應(yīng)用MassArray Typer軟件分析質(zhì)譜圖。

1.2.5 SNPs連鎖不平衡分析 采用Haploview4.2軟件對(duì)樣本中的SNPs進(jìn)行連鎖不平衡(link disequilibrium，LD)分析。

1.2.6 SNPs單體型分析 通過Haploview4.2軟件對(duì)DNMT3A和DNMT3B SNPs行單體型分析。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Plink1.06軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和質(zhì)控，兩組等位基因和基因型頻率行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，計(jì)算優(yōu)勢(shì)比(OR)及其95%CI［4］，采用 Logistic 回歸進(jìn)行矯正。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基因SNP分型結(jié)果 兩組10個(gè)SNPs位點(diǎn) DNMT3A rs1550117、rs13420827、rs11887120、rs13428812 和 DNMT3B rs6119954、rs4911259、rs4911107、rs1569686、rs2424908、rs2424932 的等位基因分別為 A/G、G/C、C/T、A/G、A/G、T/G、A/G、T/G、C/T、A/G。兩組最小等位基因頻率(MAF)均＞1%，且符合Hardy-Weinberg平衡。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，rs6119954和rs2424908在觀察組與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(rs6119954:OR=0.640，95%CI:0.411～0.996，P=0.047;rs2424908:OR=0.612，95%CI:0.405～0.926，P=0.020)。

2.2 SNPs連鎖不平衡分析結(jié)果 DNMT3A的4個(gè)位點(diǎn)之間不存在緊密連鎖(r2＜0.8)，DNMT3B基因構(gòu)建LD顯示有1個(gè)單倍型塊(haplotype Block)，由rs6119954、 rs4911259、 rs4911107、 rs1569686、rs2424908、rs2424932組成，兩兩之間存在強(qiáng)連鎖(rs6119954和rs4911259之間的連鎖性稍差，r2=0.83)，見圖1。

圖1 DNMT3A和DNMT3B SNPs LD分析

2.3 SNPs單體型分析結(jié)果 DNMT3A的4個(gè)位點(diǎn)不存在緊密連鎖，故未檢測(cè)到單體型;DNMT3B的6個(gè)SNP位點(diǎn)間存在緊密連鎖，本實(shí)驗(yàn)檢出4個(gè)單體型，分別為 TGTAGG、CATAGG、CGGGTA 和 CGTAGG，其中觀察組與對(duì)照組TGTAGG單體型頻率分別為86.5%、34.0%;CATAGG單體型頻率分別為40.4%、27.6%，兩組比較，P均＜0.05;CGGGTA單體型頻率分別為20.2%、18.6%，CGTAGG單體型頻率分別為2.2%、1.1%，兩組比較，P均 ＞0.05。

3 討論

據(jù)報(bào)道，CRC的發(fā)生、發(fā)展過程中既有原癌基因的激活，又有抑癌基因的失活及突變，包括遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)的改變。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)改變的主要形式，具體過程是指由DNMTs催化，以S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)作為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶上，生成5'-甲基胞嘧啶(5-mC)的過程［5］，這是脊椎動(dòng)物DNA惟一一種自然的共價(jià)修飾方式。DNMT3在腫瘤在發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，負(fù)責(zé)基因的重新甲基化。DNMT3A定位于人染色體2p33，DNMT3B定位于人染色體20q11.2。基因調(diào)節(jié)區(qū)CpG島的高甲基化被看作腫瘤抑制基因失活及其他遺傳病發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)，而DNMT3在CpG島的重新甲基化過程中發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)表明，DNMT3A和DNMT3B基因通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)甲基化過程而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)其在許多腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)［6］。最近研究顯示，DNMT3A和DNMT3B基因的單核苷酸多態(tài)性在頭頸部鱗癌、肺腺癌和肺小細(xì)胞癌、大腸腺癌、食管癌、胃癌、腎癌及白血病等多種腫瘤的發(fā)病中具有重要性［7］。

SNPs是基因組水平上由單個(gè)核苷酸變異引起的一種DNA序列多態(tài)性。由于其數(shù)目眾多、分布廣泛且相對(duì)穩(wěn)定，已被作為第三代基因遺傳標(biāo)志［8］。作為一種穩(wěn)定的遺傳基因早期突變，SNP與疾病有穩(wěn)定的相關(guān)性。因此，通過高密度SNP圖譜，用相關(guān)性分析的方法搜尋某些復(fù)雜遺傳疾病的致病基因，有助于在基因水平了解疾病發(fā)生的機(jī)制。隨著國際人類基因組單體型計(jì)劃(Hapmap)人類遺傳性圖譜的構(gòu)建，SNPs已成為人類基因組研究的重要組成部分。本研究采用的Sequenom MassArray SNP檢測(cè)系統(tǒng)，其基本原理為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)。其通過采用高密度SpectroCHIP點(diǎn)陣芯片，按照A、T、G和C的信號(hào)強(qiáng)弱及質(zhì)量差異得出模板序列信息，可高效自動(dòng)化的篩查SNPs，該系統(tǒng)作為一種高通量的檢測(cè)系統(tǒng)，適合SNPs的大規(guī)模篩查使用。

Gowher等［9］研究認(rèn)為，DNMT3A 基因突變和啟動(dòng)子甲基化會(huì)導(dǎo)致基因的mRNA表達(dá)下降亦是基因變異導(dǎo)致癌癥危險(xiǎn)性增加的機(jī)理。Wu等［10］認(rèn)為，DNMT3A基因R822H基因G→A突變后使DNMT3A與ATP的結(jié)合出現(xiàn)位阻，酶的活性(DNA修復(fù)能力)明顯下降，故DNMT3A基因R822H位點(diǎn)突變是導(dǎo)致結(jié)腸癌危險(xiǎn)性的原因。Fan等［11］研究后發(fā)現(xiàn)DNMT3A基因啟動(dòng)子區(qū)域rs1550117與胃癌的易感性緊密相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)年齡＜60歲的個(gè)體對(duì)胃癌易感性的一個(gè)分類標(biāo)志。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)DNMT3A rs13420827位點(diǎn)與卵巢癌的發(fā)生有關(guān)。本研究未能發(fā)現(xiàn)DNMT3A基因rs1550117和rs13420827與CRC相關(guān)，提示以上兩個(gè)位點(diǎn)突變可能存在組織器官的差異性。

本研究發(fā)現(xiàn)散發(fā)CRC患者DNMT3B基因rs1569686位點(diǎn)TT基因型頻率明顯高于普通人群，但值得注意的是，癌癥患者和普通人群的突變率均高于 Hong等［12］的報(bào)道，提示 DNMT3B 基因rs1569686位點(diǎn)存在明顯的種族差異。在以往的研究工作中，DNMT3A和DNMT3B SNP作為風(fēng)險(xiǎn)因素來衡量人群腫瘤的易感性，多局限于單個(gè)位點(diǎn)，而在本研究中，通過前期應(yīng)用全基因組關(guān)聯(lián)研究中國漢族人群的CRC發(fā)病情況，結(jié)合查閱的相關(guān)科研文獻(xiàn)，對(duì)發(fā)現(xiàn)的10個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行研究，結(jié)果提示DNMT3B的2個(gè)SNP位點(diǎn)rs6119954和rs2424908多態(tài)性與漢族人群CRC發(fā)病相關(guān)，這在中國漢族人群是首次報(bào)道，在其他人種亦未見報(bào)道。Hu等［13］研究證明rs1569686的TT等位基因型比其他基因型胃癌的發(fā)生率低。鮑倩等［14］通過對(duì)DNMT3B基因啟動(dòng)子區(qū)rs1569686的檢測(cè)，證實(shí)rs1569686位點(diǎn)G等位基因在CRC發(fā)生過程中是一個(gè)潛在保護(hù)因素。

連鎖不平衡研究是尋找疾病相關(guān)基因易感位點(diǎn)的手段之一，單體型分析是其不可缺少的工作，利用配對(duì)連鎖不平衡構(gòu)建單體型塊在全基因組范圍內(nèi)作圖是目前人類基因組研究的重要內(nèi)容之一［15］。我們采用基于最大期望算法(Expectation-Maximization，EM)的Haploview4.2軟件，根據(jù)等位基因頻率決定散發(fā)群體中雜合子個(gè)體的單倍型分布，得出的群體單體型頻率較接近真實(shí)情況。在本實(shí)驗(yàn)中，配對(duì)連鎖不平衡檢驗(yàn)表明，DNMT3A的4個(gè)位點(diǎn)連鎖不平衡程度較低，而DNMT3B的6個(gè)位點(diǎn)間存在強(qiáng)連鎖，除rs6119954和rs4911259之間連鎖性稍差(r2=0.83)外的其他位點(diǎn)之間接近或達(dá)到了完全的連鎖不平衡。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，達(dá)到完全連鎖不平衡的位點(diǎn)之中選擇其一即可代表其他位點(diǎn)的等位基因型。而且，此6個(gè)位點(diǎn)歸屬于一個(gè)單體型塊，能否在他們中篩選出單體型標(biāo)簽SNP(haplotype tag SNP，htSNP)，并探討與疾病的關(guān)系是我們今后的研究重點(diǎn)。

將來的研究可能是進(jìn)一步驗(yàn)證DNMT3A和DNMT3B基因位點(diǎn)與CRC的關(guān)系，如使用基因敲入技術(shù)使小鼠表達(dá)DNMT3A和DNMT3B基因位點(diǎn)突變蛋白，然后觀察小鼠CRC的發(fā)生率。而結(jié)腸癌作為多基因異常疾病，分析其他甲基轉(zhuǎn)移酶遺傳異常的連鎖不平衡關(guān)系亦非常重要。因此，CRC發(fā)病的危險(xiǎn)因素還有待于進(jìn)一步研究，以利于更全面的闡述人群CRC的發(fā)病機(jī)制。

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