HPLC法測(cè)定鹽酸伊立替康注射液的含量和有關(guān)物質(zhì)

余春梅，楊秀麗，鄭小鋒，陳家香，鄒意瓊，陳 蘭（西南藥業(yè)股份有限公司藥物研究所，重慶 400038）

鹽酸伊立替康為喜樹等植物中含有的抗腫瘤生物堿——喜樹堿的水溶性衍生物，其可抑制Ⅰ型DNA拓樸構(gòu)型異構(gòu)酶而阻礙DNA的合成，從而顯示抗腫瘤活性。本品及其代謝產(chǎn)物SN-38對(duì)細(xì)胞周期S期具有特異性抑制作用[1-3]。其制劑制備和應(yīng)用較多，本公司生產(chǎn)的鹽酸伊立替康注射液即是其中的一種。為控制該產(chǎn)品質(zhì)量，筆者建立了測(cè)定鹽酸伊立替康注射液[4-6]的含量和有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜（HPLC）法。結(jié)果表明，建立的方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確，適用于鹽酸伊立替康制劑的質(zhì)量控制。

1 材料

1200型HPLC儀、紫外檢測(cè)器、二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；AB204-E分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；H66 MC超聲儀（無錫超聲電子設(shè)備廠）。

鹽酸伊立替康注射液（自制，批號(hào):110701、110702、110703，規(guī)格:2 ml∶40 mg）；鹽酸伊立替康對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):100767-201102，純度:93.4%）；甲醇、乙腈均為色譜純，磷酸二氫鈉等均為分析純，水為注射用水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱:Hypersile Luna（2）C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相:水溶液（含0.02 mol/L磷酸二氫鈉和0.008 mol/L辛烷磺酸鈉）-乙腈-甲醇＝59∶17∶24（V/V/V），流速:1.5 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng):255 nm；柱溫:40℃；進(jìn)樣量:15μl。在此色譜條件下，取有關(guān)物質(zhì)供試品溶液進(jìn)樣，鹽酸伊立替康與有關(guān)物質(zhì)峰的分離度大于1.5，鹽酸伊立替康的拖尾因子小于1.5，詳見圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)圖譜1.鹽酸伊立替康Fig 1 HPLC chromatograms of system suitability1.irinotecan hydrochloride

2.2 測(cè)定方法

2.2.1 含量測(cè)定。取本品，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 ml約含1.0mg的溶液，搖勻，作為供試品溶液。另取對(duì)照品適量，同法操作，作為對(duì)照品溶液。取供試品溶液和對(duì)照品溶液各15μl注入色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

2.2.2 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定。精密量取“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液1 ml置于100 ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，作為對(duì)照溶液。取對(duì)照溶液15μl注入色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%；另取供試品溶液15μl，注入色譜儀，記錄色譜圖至主成分色譜峰保留時(shí)間的3倍。供試品溶液中如有雜質(zhì)峰，單個(gè)雜質(zhì)峰不得大于對(duì)照溶液主峰0.2倍（0.2%），各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照溶液主峰面積（1.0%）。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 最低檢測(cè)限。取對(duì)照品溶液，以流動(dòng)相稀釋制成系列濃度，分別進(jìn)樣，以信噪比為3時(shí)確定檢測(cè)限為1.2 ng。

2.3.2 線性試驗(yàn)。取鹽酸伊立替康對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并制成98.5、197.0、295.5、492.5、985.0μg/ml的溶液，分別進(jìn)樣，記錄峰面積。以峰面積（A）對(duì)質(zhì)量濃度（c）進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為A＝－196.12+12.01 c（r＝0.99997）。結(jié)果表明鹽酸伊立替康檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為98.5～985.0μg/ml。

2.3.3 精密度試驗(yàn)。取“2.2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD為0.09%，表明本法精密度好。

2.3.4 回收率試驗(yàn)。取樣品適量，加流動(dòng)相溶解制成含鹽酸伊立替康高、中、低（1.2、1.0、0.8mg/ml）3種水平的溶液各3份，取15μl注入色譜儀，記錄峰面積；另取鹽酸伊立替康對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 ml約含1.0 mg的溶液，同法操作；按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。結(jié)果，鹽酸伊立替康高、中、低3種水平的加樣回收率分別為99.4%（99.4%、99.6%、99.3%，RSD＝0.12%）、99.8%（99.9%、99.8%、99.7%，RSD＝0.10%）、99.6%（99.7%、99.5%、99.5%，RSD＝0.15%），平均回收率為99.6%（RSD＝0.12%）。

2.3.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)。取“2.2.1”項(xiàng)下的供試品溶液，在0、2、4、6、8 h時(shí)，分別取樣進(jìn)樣分析，測(cè)定主成分含量和有關(guān)物質(zhì)的量。結(jié)果，單個(gè)雜質(zhì)和總雜質(zhì)量基本無變化，主成分、單個(gè)雜質(zhì)和總雜質(zhì)含量的RSD分別為0.15%、1.72%、0。

2.3.6 耐用性試驗(yàn)。①流動(dòng)相比例變化的影響:將流動(dòng)相的比例調(diào)整±5%，取同一份供試品溶液，記錄雜質(zhì)峰的峰面積，以峰面積計(jì)算RSD。結(jié)果RSD＝0.78%（n＝8），表明調(diào)整流動(dòng)相比例±5%時(shí)，方法耐用性良好。②柱溫的影響:將柱溫分別調(diào)為35、40、45℃，取同一份供試品溶液，照“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，記錄雜質(zhì)峰峰面積，以峰面積計(jì)算RSD。結(jié)果RSD＝0.29%（n＝6），表明柱溫在35～45℃變化時(shí)，耐用性良好。

2.3.7 專屬性試驗(yàn)。供試品原液:精密稱取樣品，配制成含鹽酸伊立替康約為1.0 mg/ml的溶液，作為供試品原液。

精密稱取樣品5份，均加適量流動(dòng)相溶解。1份加入1 mol/L鹽酸溶液5 ml，80℃反應(yīng)2 h，加1 mol/L氫氧化鈉溶液5 ml中和，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為酸破壞溶液；1份加1 mol/L氫氧化鈉溶液1 ml，80℃反應(yīng)2 h，加1 mol/L鹽酸溶液1 ml中和，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為堿破壞溶液；1份加30%過氧化氫溶液2 ml，80℃反應(yīng)2 h，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為氧化破壞溶液；1份在100℃下加熱4 h，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為高溫破壞溶液；1份在（4500±500）lx照度下照射48 h，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為光照破壞溶液。另精密稱取按處方比例配制的空白輔料適量，配制成空白輔料溶液。分別取上述7種及對(duì)照品溶液各15μl進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，輔料不干擾主成分和有關(guān)物質(zhì)測(cè)定，各雜質(zhì)峰與主峰均能達(dá)到基線分離，表明本法專屬性良好。破壞性試驗(yàn)色譜見圖2。

圖2 破壞性試驗(yàn)色譜圖A.空白輔料溶液；B.供試品原液；C.酸破壞溶液；D.堿破壞溶液；E.氧化破壞溶液；F.高溫破壞溶液；G.光照破壞溶液；H.對(duì)照品溶液；1.鹽酸伊立替康Fig 2 HPLC chromatograms of destructive testA.blank excipient solution；B.sample stock solution；C.solution destroyed by acid；D.solution destroyed by alkali；E.solution destroyed by oxidation；F.solution destroyed by high temperature；G.solution destroyed by light；H.substance control solution；1.irinotecan hydrochloride

2.3.8 樣品測(cè)定。照“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定3批鹽酸伊立替康注射液的含量及有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果見表1。

表1 樣品測(cè)定結(jié)果Tab 1 Determination results of samples

3 討論

（1）本文主要是建立鹽酸伊立替康注射液的有關(guān)物質(zhì)和主成分含量測(cè)定方法。由于原料藥質(zhì)檢時(shí)已經(jīng)對(duì)合成過程的中間體和副產(chǎn)物進(jìn)行了控制，且在穩(wěn)定性研究中這些雜質(zhì)沒有增加，因此建立有關(guān)物質(zhì)方法時(shí)，只對(duì)單個(gè)雜質(zhì)和總雜質(zhì)的限度進(jìn)行了嚴(yán)格的控制，而未控制已知雜質(zhì)。

（2）取鹽酸伊立替康破壞性試驗(yàn)各溶液，經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)。結(jié)果，鹽酸伊立替康和破壞產(chǎn)生的雜質(zhì)均在255 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，且溶劑和輔料在此波長(zhǎng)處未見干擾，故確定本試驗(yàn)檢測(cè)波長(zhǎng)為255 nm。

（3）在前期流動(dòng)相的篩選中，曾設(shè)計(jì)了多組不同組成（磷酸鹽-甲醇、磷酸鹽-乙腈、辛烷磺酸鈉-甲醇、辛烷磺酸鈉-乙腈、辛烷/磷酸鹽-甲醇、辛烷/磷酸鹽-乙腈、辛烷/磷酸鹽-甲醇-乙腈）流動(dòng)相系統(tǒng)。結(jié)果認(rèn)為，乙腈-甲醇-水溶液（含有適量磷酸二氫鈉和辛烷磺酸鈉）組成的流動(dòng)相系統(tǒng)優(yōu)于單一的甲醇和乙腈與緩沖鹽組成的系統(tǒng)。通過調(diào)整其不同的體積比，如辛烷/磷酸鹽-乙腈-甲醇（50∶25∶25）、（55∶20∶25）、（59∶16∶25）、（59∶17∶24）等，最終確立了本試驗(yàn)采用的流動(dòng)相。在該流動(dòng)相下，主峰出峰時(shí)間合適，雜質(zhì)峰與主峰能夠完全分離，適合本品主成分含量和有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。

（4）本方法流動(dòng)相中有離子對(duì)試劑，雖然可能對(duì)分析柱損害較大，但可以更好地保持主峰的峰形，使其拖尾因子符合要求，測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確。

（5）破壞性試驗(yàn)中，由于本品在常溫下反應(yīng)時(shí)基本無新的降解產(chǎn)物產(chǎn)生，故均在80℃下進(jìn)行破壞試驗(yàn)。

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