菜豆抗炭疽病苗期鑒定條件優(yōu)化及種質(zhì)資源抗性鑒定

韓啟厚 古 瑜 于海龍 夏俊峰 劉惠靜 岳 欣 郎 朗

（天津科潤蔬菜研究所，天津 300384）

菜豆炭疽病是由菜豆炭疽菌〔Colletotrichum lindemuthianum（Sacc. et Magn.）Br. et Cav.〕引起的一種真菌性病害，可侵染菜豆葉片、莖稈及豆莢等。感病品種一旦發(fā)病，減產(chǎn)在20%～30%；當(dāng)溫度（13～26 ℃）和濕度適宜的情況下，減產(chǎn)可達(dá)到100%（王坤 等，2008）。

我國是世界上菜豆主產(chǎn)國之一，食莢菜豆產(chǎn)量居世界第一，籽用菜豆產(chǎn)量列世界第三（張子君 等，2002）。現(xiàn)階段菜豆生產(chǎn)上防治炭疽病主要采用化學(xué)藥劑防治，不僅耗費人力、物力，而且造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。選育抗炭疽病菜豆品種是防治菜豆炭疽病經(jīng)濟(jì)實用，也是最根本的措施。選育抗病品種，首先要有抗病資源，苗期接種鑒定方法是篩選抗病資源、鑒定抗病品種最有效的方法（Inglis et al.，1988）。

目前，對菜豆抗炭疽病苗期接種鑒定方法也有不少報道，但在實際操作中由于環(huán)境條件的差異，現(xiàn)有的鑒定方法主要存在以下問題：① 接種操作方法不統(tǒng)一，接種菌液濃度差異大（濃度差異在幾倍，甚至十幾倍），易產(chǎn)生誤差（馮國軍 等，2008；李梅，2009）；② 對環(huán)境條件要求高（多采用恒溫箱控溫、控濕）（馮國軍 等，2008），不容易達(dá)到要求，不利于大批量資源鑒定。本試驗結(jié)合前人鑒定方法及實際操作過程中存在的問題，對菜豆炭疽病苗期接種鑒定方法進(jìn)行改良；在溫室加小拱棚的條件下，利用優(yōu)化的方法對23份菜豆資源進(jìn)行苗期抗炭疽病接種鑒定，檢驗新方法實用性的同時了解菜豆種質(zhì)資源的抗性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌種：我國流行的毒力型炭疽病81號生理小種（編號Cll-07），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所王曉鳴研究員提供。供試材料：改良接種鑒定方法所用感病材料為雙豐2號。鑒定材料：共23份，包括雙豐類型4份、架豆王類型3份、紅花豆類型2份、九粒白類型3份、油豆類型7份、地豆類型4份。

菌種擴(kuò)繁：首先將菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基（方中達(dá)，1998）（馬鈴薯20 g、葡萄糖15g、瓊脂粉20 g、水1000mL）上，放于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，使其產(chǎn)生大量菌絲，活化病原菌，然后將PDA斜面培養(yǎng)基上產(chǎn)生的菌絲接種到產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，恒溫20 ℃條件下黑暗培養(yǎng)。接種時用無菌水沖下產(chǎn)孢培養(yǎng)基上的孢子，濾除菌絲，配制成一定濃度的孢子懸濁液，懸濁液孢子濃度采用血球計數(shù)板計數(shù)。

接種條件：接種在加溫溫室內(nèi)進(jìn)行，接菌方法采用毛筆涂抹法，接種后在幼苗上方支一小拱棚，接菌后每天噴霧保濕，始終保證幼苗葉片有細(xì)小的水霧，控制拱棚內(nèi)溫度在20～25 ℃，空氣濕度80%～100%。

1.2 試驗方法

1.2.1 產(chǎn)孢培養(yǎng)基及培養(yǎng)時間篩選 采用3種產(chǎn)孢培養(yǎng)基，分別為MA培養(yǎng)基（葡萄糖2.80 g、硫酸鎂1.23g、磷酸二氫鉀2.72 g、蛋白胨1.00 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000mL）、豆葉汁培養(yǎng)基（MA培養(yǎng)基+200 g鮮豆葉榨汁）和豆莢培養(yǎng)基（MA培養(yǎng)基+200 g鮮豆莢）。將3種滅菌后的液態(tài)培養(yǎng)基倒入直徑為90mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基厚度0.3mm左右。待培養(yǎng)基凝固后，從長滿炭疽病菌絲的PDA培養(yǎng)基上切取0.5mm見方的菌塊，轉(zhuǎn)接到產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)接1塊，蓋好培養(yǎng)皿并用封口膜封好。整個過程在超凈工作臺內(nèi)完成。接種好的培養(yǎng)皿放置在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20 ℃。

培養(yǎng)時間設(shè)置10、20、30、40d 4個處理，每個處理接上述3種不同培養(yǎng)基各3皿，3次重復(fù)。取孢子時，向長滿菌絲的培養(yǎng)皿內(nèi)加入5mL滅菌水，用毛筆輕輕刷下培養(yǎng)基表面的孢子，紗布過濾后用血球計數(shù)板測定孢子數(shù)量。

1.2.2 接種菌菌液濃度篩選 接種菌菌液濃度設(shè)3個處理，分別為1.0×106、2.0×106、3.0×106個·mL-1的孢子懸濁液，均勻涂抹到兩葉一心的菜豆幼苗第1片真葉上，每個處理5株，3次重復(fù)，共45株。分別在接種后5、7d調(diào)查發(fā)病情況。

1.2.3 病原菌培養(yǎng)時間篩選 當(dāng)菜豆幼苗兩葉一心時，分別將培養(yǎng)了10、20、30d的病原菌配成菌液濃度為2.0×106個·mL-1的孢子懸濁液，均勻地涂抹在第1片真葉上，每個處理4株，3次重復(fù)，共36株。接菌后分別于5、7d調(diào)查發(fā)病情況。

1.2.4 接種位置篩選 當(dāng)菜豆幼苗兩葉一心時，配制濃度為2.0×106個·mL-1的孢子懸濁液，均勻涂抹在第1片真葉上，設(shè)正面、背面、正面+背面3個處理，每個處理5株，3次重復(fù)，共45株。分別在接種后5、7d調(diào)查發(fā)病情況。

1.2.5 菜豆種質(zhì)資源苗期炭疽病抗性鑒定 根據(jù)上述試驗得到的菜豆苗期炭疽病接種的優(yōu)化方法，以雙豐2號為感病對照（CK），對所收集的23份菜豆種質(zhì)資源進(jìn)行苗期炭疽病抗性評價，每份材料15株，不設(shè)重復(fù)。

菜豆單株抗感分級標(biāo)準(zhǔn)和抗性評價標(biāo)準(zhǔn)參照古瑜等（2011）的方法。共分為9級：0級，葉片上無病斑；1級，葉片上有零星點狀病斑；3級，葉片上病斑較小，長1～2mm；5級，葉片上病斑較大，長2.1～5.0mm；7級，病斑大，長5.1mm以上；9級，病斑多數(shù)相連，葉片萎蔫?？剐栽u價根據(jù)病情指數(shù)來進(jìn)行劃分：高抗（HR），病情指數(shù)范圍0～25.0；中抗（MR），病情指數(shù)范圍25.1～50.0；中感（MS），病情指數(shù)范圍50.1～75.0；高感（HS），病情指數(shù)范圍75.1～100.0。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用DPS軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncans’s新復(fù)極差值法進(jìn)行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)時間對菜豆炭疽菌產(chǎn)孢數(shù)量的影響

如表1所示，3種培養(yǎng)基產(chǎn)孢數(shù)量在培養(yǎng)40d內(nèi)都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在30d時均達(dá)到最高峰，其中豆莢培養(yǎng)基的變化幅度最大。培養(yǎng)10d后，3種培養(yǎng)基產(chǎn)孢數(shù)量差異不顯著，但以豆莢培養(yǎng)基產(chǎn)孢數(shù)量最多；培養(yǎng)20、30、40d后，豆莢培養(yǎng)基的產(chǎn)孢數(shù)量均極顯著高于MA培養(yǎng)基和豆葉汁培養(yǎng)基，分別是MA培養(yǎng)基和豆葉汁培養(yǎng)基產(chǎn)孢數(shù)量的14.88、73.69倍，17.87、42.02倍和23.65、99.48倍，而MA培養(yǎng)基和豆葉汁培養(yǎng)基的產(chǎn)孢數(shù)量差異均不顯著。

表1 不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間對菜豆炭疽菌產(chǎn)孢數(shù)量的影響

2.2 菌液濃度對菜豆炭疽病發(fā)病情況的影響

如表2所示，接種第5天時，菌液濃度分別為 2.0×106個·mL-1和 3.0×106個·mL-1的處理菜豆幼苗炭疽病病情指數(shù)差異不顯著，但顯著高于1.0×106個·mL-1的處理?？梢?，菌液濃度低，幼苗發(fā)病速度慢，可能是由于菌液中孢子數(shù)量不足造成的；而菌液濃度較高時，孢子從氣孔進(jìn)入葉片組織，由于氣孔數(shù)量有限，多余的孢子不能順利進(jìn)入葉片組織，也就喪失了致病能力。因此，本試驗認(rèn)為接種菌液的最佳濃度為2.0×106個·mL-1。

表2 接種菌菌液濃度對菜豆炭疽病發(fā)病情況的影響

2.3 菌種培養(yǎng)時間對菜豆炭疽病發(fā)病情況的影響

如表3所示，隨著菌種培養(yǎng)時間的延長，菜豆幼苗炭疽病病情指數(shù)先升高后下降，接種培養(yǎng)20d菌種的菜豆幼苗炭疽病病情指數(shù)為67.86，極顯著高于接種培養(yǎng)10d和30d的處理?？梢?，菌種培養(yǎng)時間不能太短，亦不能過長，時間過長培養(yǎng)基的營養(yǎng)不能滿足孢子的生長，而使部分孢子侵染能力下降，因此接種應(yīng)選擇培養(yǎng)時間在20d左右的菌種，菜豆幼苗炭疽病發(fā)病效果最好。

2.4 接種位置對菜豆炭疽病發(fā)病情況的影響

從表4可以看出，3種接種方法均能使菜豆幼苗葉片感病。接種5d后，背面接種的菜豆幼苗炭疽病病情指數(shù)極顯著高于正面接種，背面接種不僅發(fā)病速度快，而且效果好于正面接種；背面接種和正面+背面接種的致病效果無顯著差異。接種7d后，3個處理的菜豆幼苗炭疽病病情指數(shù)均達(dá)到100。可見，炭疽病病菌均能浸染菜豆幼苗葉片正面和背面，而以葉片背面最容易侵入。綜合考慮致病效果及耗時等因素，菜豆幼苗葉片背面為最佳接種位置。

2.5 不同類型菜豆種質(zhì)資源苗期炭疽病抗性鑒定

從表5可以看出，23份菜豆材料中僅5份材料對菜豆炭疽病有抗性，其中超早三葉紫花架對菜豆炭疽病表現(xiàn)為高抗。5份抗性資源中有4份是油豆類型，1份是地豆類型，栽培區(qū)域都比較局限，而栽培面積較廣泛的架豆王類型、紅花豆類型、雙青玉豆類型、九粒白類型的材料均不抗菜豆炭疽病。

表3 菌種培養(yǎng)時間對菜豆炭疽病發(fā)病情況的影響

表4 接種位置對菜豆炭疽病發(fā)病情況的影響

表5 不同類型菜豆種質(zhì)資源苗期炭疽病抗性鑒定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗結(jié)果表明：豆莢培養(yǎng)基為最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)基，產(chǎn)孢速度最快，可以在短時間內(nèi)培養(yǎng)出試驗所需的孢子數(shù)量；2.0×106個·mL-1為最佳菌液濃度，菜豆幼苗炭疽病病情指數(shù)最高；20d為最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)時間，產(chǎn)孢數(shù)量多，侵染能力強；葉片背面為最佳接種位置，接種鑒定效果最好。

豆莢培養(yǎng)基產(chǎn)孢效果好，可能是由于豆莢中含有大量利于菌種生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，有利于孢子的產(chǎn)生，產(chǎn)孢數(shù)量多而且快，這與李梅（2009）試驗的結(jié)果相同。接種濃度是抗病性鑒定的關(guān)鍵，國外多采用 1.0×106～10.0×106個·mL-1（Fernandez et al.，2000；Celeste，2006），但以1.2×106個·mL-1居多，而國內(nèi)接種濃度基本在0.5×106～3.0×106個·mL-1（梁燕 等，1992；馮國軍 等，2008；李梅，2009；張婷 等，2012） 之間，主要是由于接種環(huán)境條件不同，導(dǎo)致接種濃度存在差異。del Río等（2003）在進(jìn)行接種鑒定時將孢子懸浮液噴霧在葉片背面，接種效果較理想。本試驗結(jié)果證實了接種菜豆葉片背面發(fā)病效果要好于正面，主要是炭疽病病原菌孢子主要經(jīng)過氣孔侵入葉片細(xì)胞，而葉片背面氣孔數(shù)量要多于葉片正面，因而染病效果更加明顯。菌種培養(yǎng)時間也是影響病菌致病力的重要因素之一。菌種培養(yǎng)時間過短或過長，侵染效果均不佳，本試驗結(jié)果與李梅（2009）的試驗結(jié)果基本一致，菌種培養(yǎng)時間20d為宜。接種方法多采用高壓噴霧或普通噴霧器噴霧（張子君 等，2002；王坤 等，2008），所需菌液較多，不僅浪費而且容易造成二次污染，改為毛筆涂抹，可以節(jié)約菌液，定量接種。本試驗優(yōu)化了菜豆苗期接種鑒定方法，在保證接種效果穩(wěn)定、可重復(fù)性強的前提下，簡化了操作步驟，減少了誤差；利用簡單工具，降低成本，提高了效率。可應(yīng)用于大批量種質(zhì)資源苗期炭疽病抗性鑒定，但苗期只是菜豆生長的一個階段，隨著菜豆的生長，其對炭疽病的抗性是否會出現(xiàn)變化，成株期植株本身或豆莢是否對炭疽病具有同樣的抗性，還需要做進(jìn)一步研究。

架豆王類型、雙豐類型、九粒白類型等國內(nèi)主栽的菜豆品種，對菜豆炭疽病81號生理小種均不具有抗性，一旦氣候條件適合，將造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。油豆類型和地豆類型資源中有部分品種對81號生理小種表現(xiàn)為抗病，有的甚至免疫，這為菜豆抗炭疽病育種提供了很好的雜交親本。81號生理小種是國內(nèi)主要流行的菜豆炭疽病生理小種，但也不能忽視對其他生理小種的研究，因此今后還應(yīng)該密切關(guān)注國內(nèi)菜豆炭疽病生理小種變異情況，并廣泛收集國內(nèi)外種質(zhì)資源，以期通過雜交及轉(zhuǎn)基因等手段培育出抗多個菜豆炭疽病生理小種的菜豆品種。

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