SYBR GreenⅠ染料法定量PCR檢測瘧原蟲感染及鑒別蟲種的臨床應(yīng)用

陳江濤 劉配芬 鐘德善 潘雪峰 楊輝 楊立業(yè) 陸志為 楊惠鈿 林敏★

Santiago-m Monte-Nguba6 Juan Carlos Salas Ehapo6 Urbano Monsuy Eyi6

瘧疾是嚴(yán)重危害人類健康和生命安全的疾病，同結(jié)核病、艾滋病一起被WHO列為當(dāng)前危害最為嚴(yán)重的三大傳染病。目前，全球仍有近100個國家和地區(qū)流行瘧疾，全球約40%人口受到感染威脅，每年有2億多人感染瘧疾，約65.5萬人死于瘧疾[1,2]。寄生人體的瘧原蟲有4種，即間日瘧原蟲（Plasmodium vivax）、三日瘧原蟲（Plasmodium malariae）、卵形瘧原蟲（Plasmodium ovale）和惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum），其中惡性瘧原蟲致病性最強，死亡率最高，是目前地球上對人類危害最嚴(yán)重的蚊媒寄生原蟲病。瘧疾流行最嚴(yán)重的地區(qū)為非洲撒哈拉沙漠以南，拉丁美洲和東南亞地區(qū)，其中，約85%的瘧疾發(fā)病和91%的死亡病例出現(xiàn)在非洲，因此瘧疾在非洲許多國家被稱為“頭號殺手”[2]。隨著我國經(jīng)濟發(fā)展，國力增強，我國援非項目以及國際交往增多，許多到非洲工作的人員感染瘧疾的機會變得越來越高[3]。

瘧疾的快速診斷和早期治療是其防治的關(guān)鍵，但目前對于瘧疾診斷的手段較為落后，多采用膠體金檢測瘧原蟲抗原或者顯微鏡鏡檢，敏感性較低，容易在瘧原蟲密度低的時候漏檢[4]；也有少數(shù)采用巢式PCR或TaqMan探針法對瘧原蟲進行檢測，但是存在著操作復(fù)雜繁瑣或者只能對單一蟲種進行檢測的缺點[5,6]。我們利用一種基于四種瘧原蟲的小亞基單位核糖體核酸（18S rRNA）共同特征序列為基礎(chǔ)設(shè)計的可對瘧原蟲進行定量且做蟲種鑒別的實時熒光定量PCR的方法，對非洲赤道幾內(nèi)亞援外醫(yī)療隊門診的華人患者進行鑒別診斷。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

150份血樣本采自非洲中國援赤道幾內(nèi)亞醫(yī)療隊馬拉博保健門診，均為我駐赤道幾內(nèi)亞中資公司的華人，采集疑似患者標(biāo)本外周血20 μL，滴在903標(biāo)本采集濾紙上（Whatman-新華公司）干燥后4℃保存?zhèn)溆?。同時做血涂片進行吉姆沙染色進行顯微鏡鏡檢[8]。陽性質(zhì)控為以往門診采集的惡性瘧原蟲鏡檢強陽性樣本。陰性質(zhì)控為惠州市中心人民醫(yī)院常規(guī)體檢樣本20例，且涂片經(jīng)鏡檢瘧原蟲陰性。

1.2 儀器及耗材

LightCycle 480II熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司），MJ mimi型梯度PCR擴增儀（美國Bio-Rad），微量加樣器（德國Eppendorf公司），超凈工作臺（中國蘇州精華設(shè)備有限公司），干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司），TGL-20B型和TGL-28C-C型臺式高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），LightCycle 480II熒光定量PCR儀專用96孔PCR板及封板膜（荷蘭Bioplastics公司）。

1.3 瘧原蟲基因組DNA（gDNA）提取

利用自配10%的Chelex-100提取瘧原蟲基因組DNA，首先剪切0.5×0.5 cm濾紙血斑，加500 μL去離子蒸餾水，震蕩30 s，然后靜置半小時以上。接著震蕩后用13 600 rpm離心4 min，棄上清。加160 μL的10%濃度的Chelex-100，振蕩后用56℃孵育2 h，接著98℃變性 8 min，振蕩 30 s，13 500 rpm 離心 1 min，然后放置于冰箱4℃冷卻半小時以上，備用。

1.4 定量PCR及熔解曲線鑒定蟲種

采用以往文獻(xiàn)報道的引物[7]：上游引物18S-qF：5'-ATAACGAACGAGATCTTAACCT-3'；下 游 引 物為 18S-qR：5'-ATCGTTCCTCTAAGAAGCTTTA-3'。引物由上海英俊生物技術(shù)（廣州）公司合成。反應(yīng)體系總體積20 μL，包括0.2 μL的HotStat DNA聚合酶（大連寶生物工程公司），4 μL的5×PCR buffer（Mg2+plus），1.6 μL 的脫氧核苷三磷酸（dNTP，10 mmol/μL），上述引物各 1 μL（5 μmol/μL），9.2 μL 的雙蒸滅菌水，1 μL的SYBR Green I染料（20×，廣州東盛生物科技有限公司）和2 μL的上述模板DNA。PCR擴增及熔解曲線分析均在LightCycle 480II 熒光定量PCR儀上進行。PCR擴增參數(shù)如下：預(yù)變性95℃ 3 min；擴增98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 20 s，共 36 個循環(huán)。熔解曲線鑒定程序如下：95℃ 1 min，40℃ 1 min，熔解曲線數(shù)據(jù)收集從60℃至95℃，溫度上升為1℃/s,且每升高1℃進行5次的數(shù)據(jù)采集，最終采用儀器軟件對Tm值進行分析。

四種瘧原蟲（間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲和惡性瘧原蟲）的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒由江蘇省寄生蟲研究所的曹俊教授構(gòu)建并贈送給本實驗室，該質(zhì)粒將四種瘧原蟲的18S rRNA的序列特征的PCR 產(chǎn)物用TA克隆法連接到以pGEM-T載體上。質(zhì)粒濃度為107copy/mL。我們將該質(zhì)粒進行梯度稀釋（1×107copy/mL，1×106copy/mL，1×105copy/mL，1×104copy/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對標(biāo)本進行定量分析。進行熔解程序后將每例樣本的Tm值與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒做對比，可以確定瘧原蟲的蟲種類型。

1.5 定量準(zhǔn)確性，敏感度評價

我們按照雙盲法，與上海之江生物生產(chǎn)的瘧原蟲通用試劑盒進行定量準(zhǔn)確性的比對，該試劑盒采用PCR結(jié)合TaqMan探針技術(shù)，引物及探針參照以往文獻(xiàn)[9～10]。將傳統(tǒng)鏡檢法與我們的方法進行檢出率的比對。將惡性瘧原蟲質(zhì)粒按10倍梯度稀釋，稀釋后溶液分別作為模板，進行熒光定量PCR擴增，確定熒光定量PCR的檢測下限，進行靈敏度的評價，稀釋后質(zhì)粒的拷貝數(shù)數(shù)值如下1×102copy/mL, 5×102copy/mL,1×103copy/mL, 5×103copy/mL, 1×104copy/mL,5×104copy/mL。

1.6 準(zhǔn)確性評價

采用Primer premer 5.0軟件針對瘧原蟲的18S rRNA基因設(shè)計出四種瘧原蟲的通用引物如下：rPLU1F: 5'-TCAAAGATTAAGCCATGCAAGTGA-3'；rPLU5R: 5'-CCTGTTGTTGCCTTAAACTTC-3'。按照反應(yīng)體系總體積50 μL，包括1 μL的DNA聚合酶（廣州東盛生物科技有限公司），5 μL的10×PCR buffer（Mg2+plus），4 μL 的脫氧核苷三磷酸（dNTP，10 mmol/μL），上述引物各 1 μL（20 μmol/μL），36 μL 的雙蒸滅菌水，2 μL的上述模板DNA。PCR擴增在MJ mimi型梯度PCR擴增儀上進行。PCR擴增參數(shù)如下：預(yù)變性95℃ 10 min；擴增 95℃ 30 s，58℃ 1 min，72℃ 1 min，共40個循環(huán)；72℃延伸5 min。產(chǎn)物為1 600 bp，送上海英俊生物技術(shù)（廣州）公司測序部進行測序，然后將測序結(jié)果在NCBI與標(biāo)準(zhǔn)序列進行比對，進行蟲種鑒定，以此為金標(biāo)準(zhǔn)與我們的方法進行比較。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用卡方檢驗對不同方法學(xué)的檢出率進行比較，用成對t檢驗對檢測的拷貝數(shù)進行比較，若P＜0.05為兩者之間存在統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 定量PCR檢測結(jié)果及準(zhǔn)確性、敏感度評價

150份血樣中，我們的檢測方法與瘧原蟲商品PCR試劑盒均檢測出陽性樣本29例，檢出陽性率19.3%，兩者之間檢出率一致（P＞0.05）。對兩個方法學(xué)的標(biāo)本拷貝檢測數(shù)進行t檢驗，兩者之間無顯著性差異（P＞0.05）。兩個方法的20例陰性對照組檢測結(jié)果一致，均為陰性。然而我們發(fā)現(xiàn)與定量PCR法不同，對150份樣本的鏡檢僅發(fā)現(xiàn)27例陽性結(jié)果，陽性率為18%，陽性樣本鏡檢結(jié)果見圖1。我們對另外2例定量PCR與鏡檢法存在差異的樣本進行分析并對血涂片進行擴大觀察范圍復(fù)檢，發(fā)現(xiàn)此2例樣本的拷貝數(shù)均在5×102～1×103copy/mL之間，蟲量較少，在擴大觀察范圍后發(fā)現(xiàn)蟲體。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒確認(rèn)該方法的敏感度為最低檢測下限為1×102copy/mL至5×102copy/mL之間。

圖 1 血涂片中的惡性虐原蟲鏡檢結(jié)果（10×100）Figure 1 The results of Plasmodium falciparum in blood smear under microscope(10×100)

2.2 蟲種鑒別準(zhǔn)確性評價

對四種人體瘧原蟲定量PCR擴增產(chǎn)物的Tm值進行分析的結(jié)果如圖2-A所示，四條熔解曲線均為單一的峰，這說明反應(yīng)中無產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物及引物二聚體。四種人體瘧原蟲擴增產(chǎn)物的Tm值分別為：惡性瘧原蟲76.5℃（圖2-A-a），三日瘧原蟲78.5℃（圖2-A-b），卵形瘧原蟲 80.6℃（圖 2-A-c），間日瘧原蟲81.7℃（圖2-A-d），間隔明顯，容易區(qū)分不同的蟲種。在本次檢測中發(fā)現(xiàn)的29例陽性樣本，經(jīng)鑒別均為惡性瘧原蟲。18S RNA基因擴增后電泳切膠回收，測序結(jié)果比對，百分之一百一致，產(chǎn)物電泳圖如圖2-B所示。

3 討論

瘧原蟲是嚴(yán)重危害人類健康的世界性疾病之一，80%的病例都發(fā)生在非洲。赤道幾內(nèi)亞共和國（The Republic of Equatorial Guinea）位于非洲中西部，西臨大西洋，北鄰喀麥隆，東、南與加蓬接壤。海岸線長482公里。屬熱帶雨林氣候，年平均氣溫24℃～26℃。赤道幾內(nèi)亞是全世界50個最不發(fā)達(dá)國家之一，由于熱帶雨林的氣候，國家的衛(wèi)生、經(jīng)濟條件差，瘧疾流行。該國從1970年與我國建交以來，我國長期派駐工程隊及醫(yī)療隊援助該國進行各項建設(shè)。由于我國的瘧疾流行基本消滅，對于瘧疾缺乏抵抗能力，因此我國的工人進駐當(dāng)?shù)馗菀赘腥警懠捕野Y狀更為嚴(yán)重。我們知道，瘧疾的早期快速診斷對瘧疾的治療是極其重要的，而當(dāng)?shù)夭捎玫闹饕秋@微鏡厚薄血片染色鏡檢法，該方法費時費力，而且要求專門的鏡檢設(shè)備和技術(shù)熟練的鏡檢員，尤其在原蟲血癥較低的時候，敏感性差，容易造成漏診和誤診[4,7]。隨著與世界各國之間的交流加強，當(dāng)?shù)氐男l(wèi)生部門已經(jīng)擁有各國捐獻(xiàn)的熒光定量PCR儀，因此我們考慮采用一種簡便，經(jīng)濟，快速的診斷方法去進行瘧疾的快速定量及蟲種的鑒別。

圖 2 四種瘧原蟲熔解曲線及18S RNA基因PCR擴增結(jié)果Figure 2 Melting cures of four kinds of Plasmodium spp and PCR results of 18S RNA gene

從我們的實驗結(jié)果可知，這種診斷四種瘧原蟲18S RNA基因的SYBR Green I定量PCR法能夠同時對瘧原蟲進行定量及蟲種鑒別。在我們的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，拷貝數(shù)在102～103copy/mL之間的時候，其敏感性優(yōu)于傳統(tǒng)的厚血膜鏡檢法，不容易漏檢。我們將其與我國臨床使用的瘧原蟲通用TaqMan法診斷試劑盒相比，對于這批樣本的檢出率無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），且相對于 TaqMan法，SYBR Green I染料熒光定量PCR技術(shù)價格低廉[9,10]，更適合當(dāng)?shù)氐膶嶋H情況。與傳統(tǒng)的巢式PCR方法相比較，這種方法無需對PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳分析，可避免產(chǎn)物引起模板污染；而且采用實時觀察反應(yīng)的方式判讀結(jié)果，可以在一定程度上避免了傳統(tǒng)PCR容易產(chǎn)生的假陽性結(jié)果。

從我們門診的數(shù)據(jù)顯示，我國工人在赤道幾內(nèi)亞感染瘧原蟲的檢出率高達(dá)19.3%，這一方面提示我們的駐外工作人員在當(dāng)?shù)貞?yīng)該做好防蚊的防護工作，另外一方面也說明當(dāng)?shù)氐寞懠擦餍星闆r是非常嚴(yán)重的，需要世界衛(wèi)生組織開展更多的支援工作區(qū)控制瘧疾的流行。因此，該方法不僅可以對瘧疾的早期快速診斷鑒別，而且可以用于抗瘧藥物療效的觀察與瘧疾疫苗使用效果進行評價。因此該方法在當(dāng)?shù)氐氖褂眉巴茝V，有利于赤道幾內(nèi)亞的衛(wèi)生部門對于瘧疾的防控及科研工作的開展。

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