微流控芯片上的精子自然優(yōu)選

鐘志敏 王維 梁廣鐵 周小棉 劉大漁

據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）評估，每7對夫婦中約有1對存在生殖障礙。我國近期調查顯示，育齡夫婦中不孕癥者比例約為10%，且發(fā)病率呈上升趨勢。近年來，輔助生殖技術（Assisted Reproductive Technology，ART）的應用使得不育夫婦實現(xiàn)妊娠生子的愿望，由不育引發(fā)的相關問題也隨之得到解決。對于最常用的ART，如試管嬰兒（In vitro fertilization，IVF）和卵細胞漿內單精子注射（Intracytoplasmic Sperm Injection，ICSI），獲取高質量精子是保證胚胎質量的關鍵因素。目前，常用的精子分選方法如上游法和密度梯度離心法，具有樣品需求量大、分選時間長、操作繁瑣以及易對精子DNA造成損傷[1]等不足。因此，現(xiàn)實醫(yī)療工作中迫切需要一種更為簡便高效的精子分選技術。

微流控技術的發(fā)展為少量細胞樣品的高效分選提供了一種便利的解決方案。近年來，一些研究者在微流控芯片上的精子分選[2～3]。例如，Chen 等[4～5]利用精子逆液流方向游動的特性在微流控芯片上對精子進行了分選；王維等[6～7]發(fā)展了基于層流的微流控芯片精子分選技術；丘天等[8]對微流控芯片篩選條件進行了優(yōu)化。上述微流控芯片精子分選方法均利用微流體特性，以無損傷操作實現(xiàn)精子分選，因而在分選同時保證了精子的活力。此外，微流控芯片因為具有操作簡便以及適合于處理少量樣品的優(yōu)點，非常適合于小體積精液樣品的處理。

在前述工作基礎上，本研究發(fā)展了一種基于微流控芯片的精子自然優(yōu)選方法。該方法借鑒了精子的體內分選機制，即利用宮頸粘液的阻滯作用實現(xiàn)精子的優(yōu)選。研究利用自行設計加工的微流控芯片，模擬生理狀態(tài)下精子與宮頸粘液相互作用實現(xiàn)了精子分選。與之前報導的精子分選方法相比，這種基于精子-宮頸粘液相互作用的芯片精子優(yōu)選方法不僅操作簡便，而且分選效率更高。

1 實驗部分

1.1 精液與宮頸粘液的來源

研究所用的35例精液樣本全部來自我院生殖不孕?？凭驮\的男性患者，患者夫婦同居一年以上，有正常的性生活，未采取任何避孕措施，未能成功懷孕，且女方?jīng)]有任何影響受孕的器質性疾病?；颊咄ㄟ^手淫方式留取精液樣本，待精液液化后，在30 min內通過計算機輔助精子分析系統(tǒng)（computer-assisted semen analysis，CASA）完成精液各項參數(shù)的檢測。

研究使用的宮頸粘液樣本全部來自我院生殖不孕?？凭驮\的女性患者，經(jīng)患者知情同意后于排卵期采集。采集后立即使用世界衛(wèi)生組織《人類精液與精子-宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊》第五版推薦的moghissi設計系統(tǒng)[9]對宮頸粘液的成絲性、羊齒化結晶程度、粘稠度和pH值等有關指標進行評分，滿分為15分。高于10分表明宮頸粘液質量較好，利于精子穿透；低于10分則表明不利于精子穿透。選取評分高于10分的宮頸粘液用于此研究。

1.2 儀器和試劑

精子洗液PureSperm Wash購自瑞典NidaCon International AB公司，計算機輔助精子分析系統(tǒng)（CASA）購自西班牙Microptic S.L.公司，聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）購自美國Dow Corning公司，SU-8 3025光刻膠購自美國Microchem公司。精子DNA完整性檢測試劑盒（包括預處理玻片，帶有低溶點瓊脂的微量離心管，帶有變性液的試管，裂解緩沖液）購自美國Halosperm公司。

1.3 微流控芯片的設計與構建

使用制圖軟件CorelDraw畫出微流控芯片的結構圖，采用軟刻蝕工藝制造如圖1a所示的微流控芯片[10]。該芯片由頂部的PDMS層與底部的載玻片封接而成，芯片尺寸為76 mm×34 mm。在PDMS層底面刻蝕有圖1b所示的流體通道，其中精液加樣池的直徑為4 mm；宮頸粘液分選通道長20 mm，寬6 mm，深度為0.02 mm，以保證只有高活動力精子單層通過分選通道；精子回收檢測池是一個不規(guī)則倒梨形結構，最寬處為18 mm，在分選通道與回收檢測池之間有密集排列的微柱陣列，便于分隔宮頸粘液與精子培養(yǎng)液。

1.4 微流控芯片精子優(yōu)選

微流體通道首先注入精子洗液，潤洗5 min。在宮頸粘液分選通道中注入5μL宮頸粘液，精子回收檢測池注入20μL精子培養(yǎng)液，使池底形成約0.04 mm的一薄層液體，以便于CASA檢測。最后在精液加樣池中加入10μL液化精液。完成加樣的芯片貼上PDMS蓋片，防止液體的蒸發(fā)。把芯片置于36.5℃溫箱中15 min。在正常生理狀態(tài)下，精子與宮頸粘液相互作用，質量好的精子能夠穿透宮頸粘液分選通道進入到精子回收檢測池。最后，吸取回收池精子進行涂片，采用WHO推薦的改良巴氏染色法染色分析精子形態(tài)并檢測精子的DNA損傷情況。

1.5 上游法優(yōu)選精子

用世界衛(wèi)生組織《人類精液與精子-宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊》第五版中推薦的上游法：取一滅菌試管加入精液1.0 mL 然后在精子液面上小心加入精子培養(yǎng)液1.5 mL，37℃ CO2培養(yǎng)箱內30°～45°傾斜上游1 h，然后小心取出，用試管吸取上層白色略濁液體，500×g 離心5 min，去上清，回收優(yōu)選后精子用于精子常規(guī)分析和DNA 完整性分析。

1.6 精子分析

使用CASA系統(tǒng)對分選精子的多項參數(shù)進行檢測，包括活力精子百分比，精子直線運動速度（straight-line velocity，VSL），平均路徑速度（average path velocity，VAP）和前向性（straightness，STR）。

同一份精液標本分別使用微流控芯片和上游法進行優(yōu)選，優(yōu)選后的精子使用CASA系統(tǒng)進行各項參數(shù)測定，同時涂片，采用改良巴氏染色法染色觀察精子形態(tài)并計算正常形態(tài)精子百分比。

精子DNA 完整性測定采用染色質擴散試驗（sperm chromatin dispersion test，SCD）方法。按照Halosperm試劑盒操作說明將精液標本置于包被瓊脂糖膠的預處理玻片上, 然后融合到低熔點的瓊脂糖凝膠中。包埋鏡子首先用酸處理, 使精子DNA變性, 然后用裂解液除去大部分核內蛋白。在沒有大量DNA斷裂碎片情況下的精子, 會呈現(xiàn)DNA 環(huán)由核向外擴散產(chǎn)生暈環(huán), 而帶有DNA 碎片的精子核狀體不出現(xiàn)暈環(huán)或暈環(huán)很小。計算每1000個精子中有DNA 損傷的精子數(shù), 計算損傷百分率。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用統(tǒng)計軟件SPSS18.0進行統(tǒng)計學分析，所測定的各項指標數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布，采用±s表示。芯片法和上游法的比較采用單因素的方差分析，P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

上游法最小精液樣品量要求不少于1.0 mL，分選時間為60 min。芯片法可以處理的最小樣品量為10μL，分選在15 min內完成。35例精液樣本的分選結果顯示：上游法的精子回收率為19.39±7.42%，而芯片法的精子回收率約為1%左右。

與原始樣品相比，精液樣本經(jīng)過上游法和芯片法分選后精子正常形態(tài)、活力精子、前向性精子以及DNA完整精子百分比均有顯著提升（表1，圖2），各參數(shù)的變化差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。同時，兩種方法分選后精子平均直線運動速度（VSL）和平均軌跡速度（VAP） 差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。

表1 使用上游法和芯片法處理后精子各參數(shù)的變化（±s，n=30）Table 1 Sperm parameters detected before and after the swinning-up and microchip treatments(±s，n=30)

表1 使用上游法和芯片法處理后精子各參數(shù)的變化（±s，n=30）Table 1 Sperm parameters detected before and after the swinning-up and microchip treatments(±s，n=30)

注：※芯片法與處理前比較，均是P＜0.01，△芯片法與上游法比較，P＜0.05；▲上游法與處理前比較，均是P＜0.01。

活力（%） 正常形態(tài)（%） VSL（μm/s） VAP（μm/s） STR（%）處理前 29.66±10.89 7.98±5.02 18.90±4.74 28.86±4.96 70.15±7.36上游法 70.66±10.81▲ 15.05±6.57▲ 23.18±5.75▲ 34.58±6.15▲ 70.85±9.03▲芯片法 93.41±6.02△ 22.28±7.42△ 35.08±16.32 41.81±15.87△ 85.02±12.18※△

圖1 基于精子與宮頸粘液相互作用的精子優(yōu)選圖Figure 1 Schematic representation of sperm sorting using the sperm-cervical mucus interaction

圖2 上游法、芯片法分選精子與分選前精子正常形態(tài)、活力精子、前向性精子以及DNA完整精子百分比的比較Figure 2 Comparison of percentages of sperms with normal morphology, high-motility, straighness and DNA integrity before and after sperm sorting

與上游法相比較，芯片法分選精子在正常形態(tài)、活力精子、前向性精子、DNA完整精子比率以及VAP和STR方面差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。微流控芯片法與上游法比較，VSL變化差異無統(tǒng)計學意義（圖3）。

圖3 上游法、芯片法分選精子與分選前精子平均直線運動速度（VSL）和平均軌跡速度（VAP）的比較Figure 3 Comparison of VSL and VAP of sperms detected before and after the sorting

3 討論

自然狀態(tài)下，女性生殖道內具有精子優(yōu)選機制，與宮頸粘液接觸的精子會沿著宮頸粘液中的粘蛋白向前游動。由于宮頸粘液具有一定的黏度，只有高活力的精子才能克服粘液的阻滯作用進入宮腔，而低活力精子、白細胞以及上皮細胞等成分則被保留在宮頸粘液中。生理狀態(tài)下到達子宮頸隱窩的精子被認為是有受精潛能的精子，這些精子的形態(tài)被認為是判斷精子正常形態(tài)的標準，其與各項生育指標包括體內、體外妊娠率都有良好的相關性，對判斷生育的預后非常有用[10]。同樣，高質量精子的獲得是人工輔助生殖技術的關鍵環(huán)節(jié)。臨床工作中使用不同類型的精子優(yōu)選方法以獲得高活力精子。這些方法或是依據(jù)精子的游動速度，或是依賴于精子的密度進行分選?？偟目磥恚F(xiàn)有精子分選方法所使用的分選機制與生理狀態(tài)下精子的優(yōu)選過程相差較遠，因而分選效果相比體內情況尚有差距。為解決上述問題，本研究發(fā)展了一種基于微流控芯片的精子自然優(yōu)選方法。實驗在分選通道內填充宮頸粘液，模擬子宮頸管內的精子篩選機制通過粘液對于精子的運動阻滯效應實現(xiàn)精子優(yōu)選。精液加樣池中的高質量精子能夠穿透宮頸粘液分選通道進入到精子回收檢測池，而低活力精子、白細胞以及上皮細胞等成分則被保留在宮頸粘液中。此外，回收池中的精子使用CASA系統(tǒng)在線分析，不僅縮短了操作時間，也減少了轉移和離心過程中可能造成的機械性和氧自由基引發(fā)的損傷。

與上游法相比較，芯片法分選精子的回收率要低很多，但活力提升非常顯著（70.66% vs 93.41%）。該結果可能是因為芯片法縮短了分選時間，因而更好地保持了精子活力有關。除精子活力外，正常形態(tài)精子比例亦是評價分選效果的主要指標。我們在實驗中觀察到在某些畸形精子雖然具有較快的游動速度，但其在宮頸粘液中無法保持直線前向運動，因而無法越過宮頸粘液的屏障。如單純依靠精子泳動速度，這部分精子是難以被篩除掉的。由于宮頸粘液的阻滯分選效應，芯片法獲得正常形態(tài)精子百分率（22.28%）顯著高于上游法（15.05%）。相應地，這些精子的VSL，VAP及STR也得到改善。這些分選的高質量精子對于提高IVF尤其是ICSI的成功率將有明顯的幫助。

與傳統(tǒng)檢測方法相比, 精子DNA 完整性是反映男性生育力的另一個重要指標[11]。離體環(huán)境中，精子接受的許多不良刺激可能會造成精子的機械性損傷和氧自由基增加，導致精子過氧化損傷，破壞精子DNA 完整性。本實驗使用的芯片精子分選方法盡量模擬生理條件，且有效縮短了分選時間，這些均有效減少了精子DNA損傷。使用本研究方法優(yōu)選出來的精子的正常形態(tài)百分率為22.28±7.42%，這一數(shù)值與從健康夫妻性交后的子宮頸隱窩精子的正常形態(tài)數(shù)取得的值30%尚有差距。究其原因，可能是由于分選通道的長度沒有達到女性子宮頸的長度3 cm有關，我們將針對該問題進行進一步改進。

4 結論

本研究發(fā)展了一種基于微流控芯片的精子分選方法，利用體內精子分選機制實現(xiàn)高活力精子的優(yōu)選。這種芯片分選方法具有操作簡便和低損傷性的優(yōu)勢，有希望為成為一種精子優(yōu)選的有力工具。

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