新疆家蠶抗菌肽對小鼠體征指標和臟器組織影響的研究

康 蘇，夏麗潔，馬 紀，張富春

(新疆大學生命科學與技術學院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊830046)

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是生物體天然免疫系統(tǒng)的重要活性物質［1－2］，多數(shù)具有廣譜高效的抗菌［3－4］及抗癌［5－6］活性，是潛在的新型抗菌和抗腫瘤藥物。AMPs通常由12～50個氨基酸組成，包括2～3個Arg及Lys等正電荷氨基酸殘基，疏水性氨基酸比率較大(通常 ＞50%)［7］，AMPs作用活性依賴多肽結構和酸堿環(huán)境［8］，多數(shù)AMPs通過影響細胞膜通透性殺滅病原菌［9－10］。因此，AMPs在食品防腐方面具有重要的應用前景，如Nisin正逐步取代傳統(tǒng)食品添加劑［11－13］;隨著抗生素濫用和病原菌對抗生素耐藥性逐漸增強［14］，開發(fā)和設計 AMPs及其類似物作為對抗耐藥菌的抗菌藥物具有重要意義［15－16］。

Cecropin 是 AMPs 中的一類，由 Hultmark［17］在Hyalophora cecropia 中分離獲得，1981 年，Steiner［18］將這種具有抗菌活性的物質命名為Cecropin?；贑ecropin的單鏈多肽結構，可利用基因工程及肽合成技術進行工業(yè)化生產，并可通過化學修飾提高其抗菌和抗癌活性，減少細胞毒性［19－20］。新疆家蠶抗菌肽(CecropinXJ)基因從阿克蘇新蠶3號蠶體中克隆獲得，已在原核和真核系統(tǒng)成功表達［21－22］。CecropinXJ屬于天蠶素－B類家族，具兩親性α－螺旋區(qū)域，信號肽26個氨基酸，成熟肽37個氨基酸，具有強熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性，抗菌譜廣，對多種癌細胞具細胞毒性作用［22－24］，在食品加工行業(yè)具有潛在應用價值［25］。

一般情況下，多數(shù)AMPs對真核生物或細胞具有低毒性［26］:口服低劑量 Nisin(0.0125～125μg/kg/d)和高劑量Nisin(15～20mg/kg/d)后，對大鼠正常生長和組織形態(tài)學無明顯影響［27－28］，且在 10、25、50mg/kg/d劑量下，Nisin對實驗鼠無明顯致畸作用;細菌素Subticin112對小鼠體征指標也無明顯影響［29］。關于CecropinXJ對實驗動物的影響仍未見報道，本研究擬通過觀察CecropinXJ對小鼠體重和臟器系數(shù)的影響，探討其對小鼠的毒副作用，為CecropinXJ抗菌產品研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新疆家蠶抗菌肽(CecropinXJ) 由本實驗室提供，蛋白濃度為2mg/mL;ICR小鼠 體重25g左右，由新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院動物實驗中心提供。

Benchmark Plus酶標儀 美國Bio－Rad公司;菲恰爾GL－12A離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司;JY92－2D超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;MP5002電子天平 上海恒平科學儀器有限公司;Leica DFC4800倒置熒光顯微鏡 德國Leica公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 CecropinXJ的提取 將鑒定正確的重組質粒pET32a－CecropinXJ在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上劃線，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng);挑取單菌落接種到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220r/min過夜培養(yǎng);次日按1%體積比轉接至含氨芐青霉素的新鮮培養(yǎng)基，37℃，200r/min震蕩培養(yǎng)菌液至 OD600為0.6～0.8;加入IPTG至終濃度為0.8mmol/L，37℃誘導5h;4℃，12000r/min，離心10min，收集菌體;PBS 洗滌菌體3遍后，重懸于PBS中，冰浴進行超聲波細胞破碎 5s，間歇 5s，200w，工作 30min;4℃，12000r/min，離心10min，取上清和沉淀進行Tricine－SDS－PAGE電泳檢測［30］。

1.2.2 CecropinXJ的純化 將超聲裂解后的上清液用0.22μm微孔濾膜過濾后，參照 Ni SepharoseTM6 Fast Flow說明書對帶有His標簽的融合蛋白進行親和純化，取樣進行Tricine－SDS－PAGE電泳檢測，分析純化效果［30］。

1.2.3 實驗小鼠的飼養(yǎng)及灌胃 取體重25g左右的健康ICR雌鼠12只，隨機分成4組，每組3只。灌胃前2h稱重，平均值作為實驗初重，分別按不同濃度(10、20、40mg/kg/d)的 總 CecropinXJ 和 純 化CecropinXJ(純度達到85%)對小鼠進行灌胃，生理鹽水作對照(CK)，連續(xù)灌胃 7d［31］。

1.2.4 實驗小鼠的觀察和指標測定 在連續(xù)灌胃7d里，連續(xù)記錄小鼠的生長狀態(tài)及體重變化;第8d將小鼠處死，解剖取肝臟、胃、脾臟和胰臟，在電子天平上稱重，計算小鼠各臟器系數(shù)［32］。

1.2.5 實驗小鼠病理組織學切片 選取小鼠的胃和肝，制作石蠟切片，用37%～40%的甲醛固定，經脫水－透明－浸蠟－包埋－切片－粘片－脫蠟－染色－膠封等一系列處理后鏡檢，拍照［33］。

1.2.6 統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，采用GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 CecropinXJ對小鼠一般狀態(tài)的影響

在連續(xù)灌胃的7d里，各組小鼠精神狀態(tài)良好，飲食、飲水正常，被毛光亮，糞便正常，實驗期間死亡率為0。

2.2 CecropinXJ對小鼠體重的影響

通過7d的連續(xù)實驗，在最初1d，體重稍有下降，可能是因為小鼠接觸外來物質需要一個適應過程。之后幾天，經統(tǒng)計學分析，結果顯示，小鼠體重在CecropinXJ與生理鹽水對照組之間，無顯著性差異(p＞0.05)(圖1)，說明CecropinXJ對小鼠體重增加無明顯抑制作用，對小鼠生長無明顯影響。

圖1 不同濃度CecropinXJ對小鼠體重的影響Fig.1 The influence of mice body weight with different doses of bacterial protein

2.3 CecropinXJ對小鼠臟器系數(shù)的影響

在獲取小鼠內臟(肝臟、胃、脾臟和胰臟)后稱量，與小鼠體重計算臟器系數(shù)，進行統(tǒng)計分析后作圖，如圖2。結果表明:實驗小鼠灌胃總CecropinXJ時(圖2A)，小鼠內臟(胃、脾和胰)系數(shù)均在正常范圍內，不同處理組間各臟器系數(shù)變化無顯著差異(p＞0.05);實驗小鼠灌胃純化 CecropinXJ時(圖2B)，小鼠胃、脾臟和胰臟系數(shù)在不同處理組間無顯著差異(p＞0.05)，但肝臟系數(shù)與對照組相比有顯著性差異(p＜0.05)，說明高純度高濃度的CecropinXJ對小鼠肝臟系數(shù)有影響。

2.4 病理組織學觀察

圖2 不同濃度CecropinXJ對小鼠內臟系數(shù)的影響Fig.2 The influence of mice organ coefficients with different doses of CecropinXJ

病理組織切片可以在細胞水平上反映外緣物質是否對器官組織造成了損傷。按40mg/kg/d劑量灌胃小鼠，解剖后，取其肝臟和胃做石蠟切片。若CecropinXJ對小鼠有毒性作用或造成小鼠發(fā)生炎癥反應，小鼠臟器會出現(xiàn)一些病例變化，如肝臟表現(xiàn)為淤血、狄氏隙顯現(xiàn)、肝細胞變性、散在性肝細胞壞死和淋巴細胞浸潤等，脾臟表現(xiàn)為淋巴濾泡輕度排空和巨噬細胞增多等。灌胃總CecropinXJ實驗組相較于生理鹽水對照組，肝結構清晰完好，排列有序，肝細胞未見明顯變性、壞死(圖 4A);灌胃純化的CecropinXJ實驗組(40mg/kg/d)相較于生理鹽水對照組，組織切片結果顯示肝細胞排列疏松，有間隙(圖4B);不同CecropinXJ實驗組與對照組相似，胃結構清晰完好，胃粘膜無變形無損傷。灌胃給藥后的胃未見有炎癥反應、器官水腫或細胞壞死等現(xiàn)象，說明CecropinXJ對小鼠胃無明顯損傷(圖3)。

圖3 CecropinXJ灌胃小鼠胃的石蠟切片毒理檢測Fig.3 The toxicity detection of paraffin section of mouse stomach treated by gavage of CecropinXJ

3 結論與討論

圖4 CecropinXJ灌胃小鼠肝臟的石蠟切片毒理檢測Fig.4 The toxicity detection of paraffin section of mouse liver treated by gavage of CecropinXJ

毒理研究中動物的體重變化是機體各器官、系統(tǒng)發(fā)育狀況的總和，是反映受試毒物對機體毒性作用的一項綜合指標，對于判斷受試物毒性作用強度有一定的參考價值［34］。因大多數(shù)雌性動物耐受性強于雄性，且個體之間差異小，故選用雌性小鼠進行實驗。通過7d的連續(xù)實驗，除第一天體重稍有下降外，后續(xù)幾天實驗組小鼠體重相較于對照無明顯變化，可能是因為小鼠初次接觸外來物質需要一個適應過程。

臟器系數(shù)又稱臟體比，是實驗動物某臟器的重量與其體重之比值。臟器系數(shù)常能反映實驗動物總的營養(yǎng)狀態(tài)和內臟的病變情況，臟器系數(shù)增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等;臟器系數(shù)減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變。正常狀態(tài)下，臟器系數(shù)比較恒定，當接觸外來物質致使臟器受到損害，臟器重量發(fā)生改變，臟器系數(shù)將發(fā)生變化［32］。本研究中，灌胃總CecropinXJ實驗組中，小鼠的肝臟、胃、脾臟及胰臟系數(shù)略高于對照組，但與對照組比較均無顯著性差異(p＞0.05);灌胃純化CecropinXJ實驗組中，小鼠的胃、脾臟及胰臟系數(shù)與對照組相比均無顯著性差異(p＞0.05)，但肝臟系數(shù)在灌胃40mg/kg/d實驗組與對照組中存在顯著性差異(p＜0.05)，而其他組無明顯差異(p＞0.05)。因為肝臟作為動物體內臟里最大的器官，對機體排毒起重要的作用，灌胃高濃度純化(40mg/kg/d)的CecropinXJ引起肝臟系數(shù)的顯著增加，表明較高純度和濃度的CecropinXJ對肝臟有影響。

石蠟切片(paraffin section)是組織學常規(guī)制片技術中最為廣泛應用的方法。石蠟切片不僅用于觀察正常細胞組織的形態(tài)結構，也是病理學和法醫(yī)學等學科用以研究、觀察及判斷細胞組織形態(tài)變化的主要方法，且已廣泛地應用于其他學科領域的相關研究。本研究對灌胃CecropinXJ小鼠的肝臟和胃進行切片毒理檢測，結果顯示CecropinXJ對小鼠胃沒有顯示出明顯病理變化，而純化的CecropinXJ僅在灌胃40mg/kg/d時，小鼠肝臟顯示出明顯病理變化。說明高純度高濃度的CecropinXJ對小鼠的肝臟有病理上的損傷。

本 實 驗 結 果 與 Nisin［26－27］、Subticin112［29］及Piscicolin126［35］等的動物實驗結果基本相符，高純度大劑量的CecropinXJ對小鼠肝臟系數(shù)有一定的影響，對小鼠的肝臟有病理上的損傷。這需要進一步對CecropinXJ的系統(tǒng)毒性(systematical toxicity)進行評估，以確定其整體的毒理作用。

本研究通過檢測CecropinXJ灌胃小鼠的體征指標，并對胃和肝臟進行切片病理組織學檢測，結果表明，高純度大劑量(40mg/kg/d，純度 85%)CecropinXJ除對實驗小鼠肝臟系數(shù)有影響外，對小鼠的生長生活、體重及其它臟器系數(shù)均無顯著影響;其他劑量CecropinXJ對實驗小鼠臟器系數(shù)無明顯影響。石蠟切片表明總CecropinXJ對小鼠的胃和肝臟均無明顯的毒理性反應和病理變化，而高純度大劑量(40mg/kg/d，純度85%)的 CecropinXJ對小鼠肝臟有毒理性反應和病理變化。

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