雙孢菇廢棄物菇柄多糖提取工藝研究

侯傳偉，王安建，李順峰，沈 琪，2，魏書信

(1.河南省農(nóng)科院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所，河南鄭州450002;2.河南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，河南鄭州450002)

多糖具有多種生物活性，可提高免疫力、降血糖、抗腫瘤、抗病毒等，由于其功能獨特，并且毒性較低，因此在抗衰老、抗病毒和腫瘤、糖尿病治療等方面有良好的應(yīng)用前景［1］。同時多糖還可以改善食品的食用品質(zhì)、加工特性和外觀特性，可用于抑制脂質(zhì)氧化［2］，穩(wěn)定酸性飲料［3］，作為乳化劑［4］等，在食品中的用途十分廣泛。雙孢菇(Agaricus Bisporus)屬傘菌目蘑菇科蘑菇屬大型真菌，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，享有“素中之王”的美稱，是我國目前出口量最大、創(chuàng)匯最高的一種食用真菌［5－7］。雙孢菇不僅是一種味道鮮美，營養(yǎng)齊全的菇類蔬菜，而且是具有保健作用的健康食品，含有多種有效藥物成分，其中多糖是重要成分之一［8］。然而，在雙孢菇收獲和加工過程中大量的菇柄作為廢棄物被丟棄，既污染環(huán)境又造成了資源的浪費。因此，從雙孢菇廢棄物菇柄中提取有效功能成分，不僅可以減少對環(huán)境的污染，還可以提高菇農(nóng)和蘑菇生產(chǎn)加工企業(yè)的經(jīng)濟效益，對雙孢菇廢棄物菇柄進行合理的開發(fā)和利用具有重要的現(xiàn)實意義。本實驗采用單因素和正交實驗法［9－10］對水提醇沉法［11］提取雙孢菇菇柄多糖的條件進行優(yōu)化研究，以確定最佳的提取工藝，為雙孢菇廢棄物菇柄多糖產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙孢菇菇柄 采自河南省駐馬店西平縣食用菌培養(yǎng)基地;葡萄糖(105℃干燥至恒重)、98%濃硫酸、重蒸苯酚、無水乙醇等 均為國產(chǎn)分析純;實驗用水 均為蒸餾水。

GZX－9140MBE型數(shù)顯鼓風干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;萬能粉碎機 上海金剛電器廠;精密電子天平 常州萬泰天平儀器有限公司;HZ－B水浴恒溫振蕩器 上海博遠實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;H2050R型高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;UV－2802型紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖含量測定 采用硫酸－苯酚法測定多糖含量［12－13］。分別精確吸取濃度為100mg/L的葡萄糖標準溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 置于 25mL 比色管中，加水至2.0mL，再分別加入5%重蒸苯酚溶液1.0mL和濃硫酸5.0mL，搖勻放置10min后，置于20～30℃水浴中保溫15min。然后在490nm波長處測定吸光值，以葡萄糖含量(mg/mL)為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線(圖1)，回歸方程為y=7.8389x+0.0034(R2=0.9997)。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

1.2.2 雙孢菇菇柄多糖提取方法 本實驗采取水提醇沉的方法提取雙孢菇菇柄中的多糖，提取方法［14］如下:雙孢菇菇柄40℃烘干后粉碎過60目篩，準確稱取干粉2.00g，加適量水，在一定溫度下水浴一段時間后4000r/min離心10min，上清液定容至50mL。取定容后上清液10mL，加入適量乙醇，混勻，置4℃冰箱中醇析沉淀多糖1h，4000r/min離心10min，棄上清液，所得沉淀用水溶解后定容至50mL。吸取上述溶液0.5mL，按1.2.1步驟測定多糖含量。每組實驗重復(fù)3次，取其平均值。依據(jù)標準曲線，計算多糖得率。

多糖得率(%)=多糖量/雙孢菇菇柄量×100

1.2.3 雙孢菇菇柄多糖提取正交實驗設(shè)計 依據(jù)單因素實驗結(jié)果，采用L9(34)正交實驗設(shè)計對雙孢菇菇柄多糖提取進行優(yōu)化。正交實驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 正交因素水平Table 1 Factor levels of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 浸提溫度對多糖得率的影響 在液固比15∶1的條件下，控制浸提溫度為 50、60、70、80、90℃的恒溫水浴中提取60min，提取一次，測定結(jié)果如圖2。隨著浸提溫度的升高，多糖得率也增加，故選90℃較好。有研究報道，溫度升高可增加多糖的擴散系數(shù)和溶解性，有利于多糖從材料介質(zhì)中進入提取溶劑內(nèi)，從而可提高多糖的得率［15－16］。

圖2 浸提溫度對雙孢菇菇柄多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides from Agaricus bisporus waste stipe

2.1.2 液固比對多糖得率的影響 按液固比5∶1、10∶1、15∶1、20 ∶1、25 ∶1，在 90℃ 恒溫水浴中浸提60min，提取一次，測定結(jié)果如圖3。由圖可知:隨著液固比的增加，多糖得率也逐漸增加，但在液固比達到15∶1時再增加水溶液的比例，其多糖得率的增加不明顯，液固比為 25∶1時僅比 15∶1時增加了0.14%，考慮后續(xù)工作和節(jié)約溶劑用量等綜合因素，故選擇液固比15∶1為宜。張民等［17］報道水體積的增加有利于多糖物質(zhì)的運輸，從而可以提高多糖的提取率，但超過一定比例后影響并不顯著。

圖3 液固比對雙孢菇菇柄多糖得率的影響Fig.3 Effect of ratio of liquid to solid on the yield of polysaccharides from Agaricus bisporus waste stipe

2.1.3 浸提時間對多糖得率的影響 在液固比15∶1，浸提溫度為90℃的恒溫水浴中分別浸提30、60、90、120、150、180min，提取一次，測定結(jié)果如圖 4 所示。由圖4可以看出，在浸提時間為30～60min時，多糖得率由3.50%增加到4.00%，繼續(xù)延長浸提時間，多糖得率不再增加反而下降，故選較優(yōu)浸提時間為60min。

2.1.4 提取次數(shù)對多糖得率的影響 在液固比15∶1，浸提時間60min，浸提溫度為90℃的恒溫水浴中分別浸提1、2、3次，測定結(jié)果如表2。由表2可知，隨著提取次數(shù)的增加，多糖得率逐漸增加，但提取3次與提取2次結(jié)果相差不多，綜合考慮產(chǎn)率、能耗等因素，選擇提取2次為好。

圖4 提取時間對雙孢菇菇柄多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides from Agaricus bisporus waste stipe

表2 提取次數(shù)對雙孢菇菇柄多糖得率的影響Table 2 Effect of extraction times on the yield of polysaccharides from Agaricus bisporus waste stipe

2.1.5 乙醇用量對多糖得率的影響 按液固比15∶1，在90℃恒溫水浴中浸提60min的條件下，分別加入1、2、3、4倍量的無水乙醇，置冰箱醇析 1h。測定結(jié)果如圖5，在實驗范圍內(nèi)，隨乙醇用量的增加多糖得率隨之增加，乙醇用量達2倍體積后多糖得率增加不顯著，故選2倍乙醇用量沉淀多糖較合適。

圖5 乙醇用量對雙孢菇菇柄多糖得率的影響Fig.5 Effect of volume of ethanol to extract for precipitation on the yield of polysaccharides from Agaricus bisporus waste stipe

2.1.6 醇沉時間對多糖得率的影響 按液固比15∶1，在90℃恒溫水浴中浸提60min的條件下，加入2倍量的無水乙醇，分別置冰箱醇析 0.5、1、2、3、4h。測定結(jié)果如圖6。由圖可明顯看出，醇析2h時多糖得率最高，而在醇沉時間為3h和4h時，多糖得率與醇析2h無顯著差異，故選2h醇析為好。

2.2 正交實驗結(jié)果

以多糖提取得率為指標，對雙孢菇菇柄多糖的提取條件進行優(yōu)化。正交實驗結(jié)果及方差分析見表3、表4。

從表3中的極差R可看出，對多糖得率的影響依次為D＞B＞A＞C，即影響多糖提取的最主要因素是提取次數(shù)，其它依次為浸提時間，浸提溫度，液固比。由表4可見，提取次數(shù)的F值達到顯著水平(p＜0.05)，即提取次數(shù)對多糖得率的影響顯著。由表3中的k值可以看出，用熱水浸提多糖的最佳工藝組合為 A2B3C2D3，即浸提溫度 85℃、浸提時間90min、液固比15∶1、提取3次，經(jīng)測定多糖提取得率為5.50%。

圖6 醇沉時間對雙孢菇菇柄多糖得率的影響Fig.6 Effect of ethanol precipitation time on the yield of polysaccharides from Agaricus bisporus waste stipe

表3 正交實驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Results of variance of analysis

3 結(jié)論

通過單因素實驗和正交實驗表明，在熱水浸提雙孢菇廢棄物菇柄多糖的過程中，影響多糖得率的主要因素依次為提取次數(shù)、浸提時間、浸提溫度、液固比。通過正交實驗分析優(yōu)化，在乙醇用量為2倍體積，醇析時間為2h時，最佳提取工藝參數(shù)為浸提溫度85℃、浸提時間90min、液固比為15∶1、提取次數(shù)為3次，此時多糖得率可達5.50%。

［1］尹艷，高文宏，于淑娟.多糖提取技術(shù)的研究進展［J］.食品工業(yè)科技，2007，28(2):248－250.

［2］Matsumura Y，Egami M，Satake C，et al.Inhibitory effects of peptide－bound polysaccharides on lipid oxidation in emulsions［J］.Food Chemistry，2003，83(1):107－119.

［3］Akihiro N，Hitoshi F，Masayoshi K，et al.Effect of soybean soluble polysaccharides on the stability of milk protein under acidic conditions［J］.Food Hydrocolloids，2003，17(3):333－343.

［4］Akihiro N，Taro T，Ryuji Y，et al.Emulsifying properties of soybean soluble polysaccharide［J］.Food Hydrocolloids，2004，18(5):795－803.

［5］徐朝暉，姜世明，付培武.雙孢蘑菇子實體多糖的提取及其對癌細胞的抑制［J］.中國食用菌，1997，6(4):5－7.

［6］孫婭，李志強，王毓寧，等.采后鈣處理對雙孢菇貯藏生理的影響［J］.食品工業(yè)科技，2013，34(2):322－326.

［7］王春麗，張琳，祖元剛，等.雙孢菇水提物抗疲勞作用研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(5):379－380，417.

［8］吳疆，班立桐.應(yīng)用雙水相萃取技術(shù)提取雙孢蘑菇多糖的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2011，32(7):4－7.

［9］熊澤，邵偉，黃藝.雙孢磨菇多糖提取工藝優(yōu)化研究［J］.三峽大學學報:自然科學版，2007，29(4):367－370.

［10］王欽德，楊堅.食品實驗設(shè)計與統(tǒng)計分析［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2003:331－367.

［11］吳疆，班立桐.應(yīng)用雙水相萃取技術(shù)提取雙孢蘑菇多糖的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2011，32(7):4－7.

［12］張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)［M］.杭州:浙江大學出版社，1999.

［13］Dubios M，Gilles K A，Hamilton J K，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances［J］.Analytical Chemistry，1956，28(3):350－356.

［14］李順峰，劉興華，張麗華，等.真姬菇子實體多糖的提取工藝優(yōu)化［J］.農(nóng)業(yè)工程學報，2008，24(2):281－284.

［15］CaiW，Gu X，Tang J.Extraction，purification，and characterization of the polysaccharides from Opuntia milpa alta［J］.Carbohydrate Polymers，2008，71(3):403－410.

［16］楊詠潔，梁成云，崔福順.薺菜多糖的超聲波提取工藝及其抑菌活性的研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，31(4):146－149.

［17］張民，秦培軍，陳倩娟.大蒜多糖提取分離工藝及分子量分布［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35(7):160－163.