從制備血紅蛋白肽的血渣中提取血紅素

衛(wèi)樂紅，時亞文，姜無邊，陳石良，*

(1.湖北奧彤生物制品科技有限公司，湖北孝感432600:2.湖北寶迪農(nóng)業(yè)科技有限公司，湖北孝感432600)

我國有豐富的豬血資源，從豬血中可以得到超氧化物歧化酶(SOD)、凝血酶、血紅素鐵、蛋白粉等生化產(chǎn)品，如果能夠得到充分的開發(fā)利用，將是一筆極其巨大的財(cái)富［1］。血紅素的原料來源比較窄，一般是從動物的血液中提取，隨著動物血液的開發(fā)應(yīng)用，其價格不斷上升。從制備超氧化物歧化酶或血紅蛋白肽的血渣中提取，如果技術(shù)得當(dāng)，生產(chǎn)血紅素的成本可以大大降低。血紅素是人體中血紅蛋白的活性中心，其核心部位為鑲嵌在卟啉環(huán)中心的二價鐵離子，具有攜氧能力［2］。血紅素是暗紫色有光澤的細(xì)微針狀結(jié)晶或黑褐到棕色顆粒，顏色隨純化溶劑的不同而略有區(qū)別。在干燥的固體狀態(tài)下血紅素比較穩(wěn)定，但在有光和氧化物的存在下容易被破壞，對熱比較穩(wěn)定。能溶于酸性丙酮、堿性溶液、熱醇等溶劑中，不溶于水、稀酸、醚和氯仿［3］。主要存在于動物的血液中，具有重要的生理功能和很高的實(shí)用價值，在醫(yī)藥、保健品、食品、精細(xì)化工、化妝品等行業(yè)有廣泛的應(yīng)用［4］。鐵是一種重要的微量元素，血紅素是一種重要的膳食鐵來源，在西方飲食中，有三分之二的鐵是由血紅素提的，主要來源于肌紅蛋白和血紅蛋白［5］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮紅血球 寶迪農(nóng)業(yè)科技有限公司恩彼事業(yè)部取來，通過水溶脹法溶血后用復(fù)合酶水解，上清液脫色噴霧干燥后即為血紅蛋白肽，下層沉淀作為提取血紅素的原料于4℃冰箱中儲存?zhèn)溆?NaHSO3、鹽酸、丙酮、無水乙醇、乙醚、醋酸鈉均為分析純 廣東金華科技股份有限公司;氯化血紅素標(biāo)品為生化試劑 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

紫外可見分光光度計(jì) UV－VIS 745，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;離心機(jī) D275M，長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司;電子天平 DJ－6002，福州華志科學(xué)儀器有限公司;分析天平 BSA 224S－CW，賽多利斯科學(xué)儀器，北京有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱 DAG－9070A型，上海飛越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;定時電動攪拌器 JJ－1，江蘇金壇市中大儀器廠。

1.2.1 酸性丙酮法提取血紅素的工藝流程

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 取50g血渣，根據(jù)質(zhì)量體積比加入不同體積的鹽酸丙酮混合溶液，充分?jǐn)嚢瑁?000r/min離心10min，血紅素留在上清液中，取上清液。用2mol/L的NaOH調(diào)節(jié)上清液pH至5，并按體積比加入醋酸鈉溶液攪拌均勻靜置使血紅素沉降，6000r/min離心10min，沉淀即為血紅素。將沉淀分別用去離子水、無水乙醇以及乙醚洗滌兩次，60℃烘箱干燥即可。分別設(shè)置酸酮比(1∶100、2∶100、3∶100、4∶100、5∶100)、料液比(1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6)和攪拌時間(5、10、15、20、25min)三個單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 選定鹽酸丙酮體積比、料液比、攪拌時間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定正交實(shí)驗(yàn)的工藝條件，通過正交實(shí)驗(yàn)確定優(yōu)化的提取工藝條件，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 血渣中提取氯化血紅素的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization factors in the orthogonal array design

1.2.4 血紅素粗品的純化 采用劉任民［6］等的方法稍有改動，粗血紅素用0.1mol/L的NaOH充分溶解，6000r/min去掉沉淀，取上層溶液用1mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至5，加入1g/100mL的醋酸鈉，使血紅素沉淀下來，離心取沉淀，用去離子水反復(fù)清洗3次，95%的乙醇清洗兩次，乙醚清洗一次后60℃烘箱干燥即可。

1.2.5 血紅素各項(xiàng)指標(biāo)檢測方法建立

1.2.5.1 血紅素鑒定

a.顯色反應(yīng):采用袁曦［7］等的方法，取血紅素鐵2mg，加0.1mol/L的氫氧化鈉溶液2mL于熱水中溶解，冷卻后加20%的硫酸溶液8mL，混合均勻，即生成棕色沉淀。過濾后取濾液1mL，加入硫酸氫銨試劑數(shù)滴，搖勻，溶液顯棕紅即為血紅素鐵。取標(biāo)準(zhǔn)樣品2mg，以同樣的操作方法作為對比。

b.血紅素的紫外掃描:分別取0.01g血紅素標(biāo)準(zhǔn)品和樣品血紅素，用0.1mol/L的氫氧化鈉溶解定容到100mL，用紫外可見分光光度計(jì)在200～800nm處掃描。

1.2.5.2 氯化血紅素含量的檢測

a.氯化血紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:取一定量的氯化血紅素標(biāo)準(zhǔn)品，105℃烘箱干燥4h以除去水分，精確稱取20mg干燥好的標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1mol/L的NaOH溶解，定容至 100mL 分別吸取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL置于100mL的容量瓶中，用0.1mol/L的NaOH溶液定容至刻度，搖勻。以0.1mol/L的NaOH為空白，與385nm處測定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0758x－0.0008，R2=0.9998。

b.氯化血紅素樣品含量的測定:取經(jīng)過105℃干燥至恒重的氯化血紅素樣品，研成粉末;精密稱取適量樣品，置于100mL燒杯中，加0.1mol/L的氫氧化鈉溶液溶解，將溶液轉(zhuǎn)移到 100mL容量瓶中，加0.1mol/L的氫氧化鈉溶液至刻度，搖勻，過濾。取濾液10mL于100mL容量瓶中，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，以0.1mol/L的氫氧化鈉溶液為空白。在385nm波長處測定其吸光度A。代入回歸方程即可求算氯化血紅素的含量，酶解血渣中的氯化血紅素含量為0.864g/100g，其血紅素提取率計(jì)算公式如式(1)。

1.2.5.3 氯化血紅素中鐵含量的測定

a.原子吸收分光光度法測氯化血紅素鐵含量

標(biāo)準(zhǔn)溶液:按國標(biāo)GB/T 5009.90－2003的方法進(jìn)行測定，準(zhǔn)確稱量1g的精制鐵粉，用硝酸溶解，然后用0.5N的硝酸溶液定容到1000L，此溶液相當(dāng)于1mg/mL，分別量取 0.5、1、2、3、4mL 標(biāo)準(zhǔn)使用液于100mL的容量瓶中，用0.5N的硝酸定容搖勻，用原子吸收分光光度計(jì)測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品中鐵含量的測定:精確稱取均勻干燥的樣品1、2、3與標(biāo)準(zhǔn)樣品40mg，于100mL的燒杯中，加入混合酸消化液20mL，上蓋表皿，置于可調(diào)功率電爐中消化，直至無色透明為止，加入幾毫升去離子水，繼續(xù)加熱以除去多余的硝酸，待燒杯中溶液為2～3mL時，取下冷卻，用去離子水洗并移于10mL的刻度管中，用去離子水定容到10mL。空白用相同體積的混合酸消化液消化，步驟與上相同。

b.磺基水楊酸法測血紅素中鐵含量

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取0.7030g硫酸亞鐵銨于100mL的燒杯中，加入50mL 1mol/L鹽酸溶液，完全溶解后移入1L容量瓶中，再加入50mL 1mol/L，再用蒸餾水稀釋至刻度，混勻。取6支100mL的容量瓶編號，分別用移液槍取 0、1、2、3、4、5mL 鐵標(biāo)準(zhǔn)液于100mL容量瓶中，每份分別加入20%的磺基水楊酸7mL，然后加入1∶1的氨水2mL，使溶液由紅色變?yōu)榉€(wěn)定的黃色，再過量1mL，稀釋至刻度，搖勻。在分光光度計(jì)上選取最大吸收波長，λ=420nm，使用蒸餾水作為參比液，分別測定1～6號容量瓶吸光值，重復(fù)一次，然后取平均值，以測得的的吸光值為縱坐標(biāo)，溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品鐵含量的測定:配置樣品溶液，放入100mL的容量瓶中，按上述方法顯色并測其吸光值，求出樣品鐵含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 鹽酸丙酮添加量對氯化血紅素含量和提取率的影響 血紅蛋白是由4分子的血紅素和1分子的珠蛋白結(jié)合而成的，在酸性條件下，血紅蛋白中原先不帶電荷的埋藏在分子內(nèi)部的組氨酸殘基(PI=7.0)，由于帶有負(fù)電荷而暴露出來，此時血紅素和珠蛋白的結(jié)合較為疏松，蛋白質(zhì)在丙酮的作用下沉淀后血紅素則留在溶液中［8］。料液比為5∶1，攪拌時間為20min，醋酸鈉添加量與提取液體積比為1∶100的條件下，由表2可知不同的酸酮比對氯化血紅素的含量有一定的影響，隨著鹽酸添加量的不斷增加，血紅素的含量和提取率持續(xù)上升，當(dāng)酸酮比為3∶100時，得到的產(chǎn)品的含量和提取率都較高，分別達(dá)到了97.91%和63.50%。

表2 鹽酸丙酮比對氯化血紅素含量和提取率的影響Table 2 Effect of hydrochloric acid and acetone volume ratio on hemin purity and yield

2.1.2 料液比對氯化血紅素的含量以及提取率的影響 提取過程中加入丙酮是為了溶出血紅素并使蛋白質(zhì)變性沉降下來，用量過少不能使蛋白質(zhì)充分沉降，而用量過大料液比超過1∶6時，則產(chǎn)量不穩(wěn)定，過濾困難［9］。在鹽酸丙酮體積比為3∶100，攪拌時間為20min，醋酸鈉添加量為1%的條件下，由表3可知:隨著酸性丙酮添加量的加大，提取的樣品的質(zhì)量下降，這可能是因?yàn)楸牧吭黾?，使珠蛋白沉降的更充分。?dāng)料液比為1∶5時，含量達(dá)到了最大值，再加大酸性丙酮的添加量時含量和提取率變化不大。

表3 料液比對氯化血紅素含量和提取率的影響Table 3 Effect of solid－liquid ratio on hemin purity and yield

2.1.3 攪拌時間對氯化血紅素的含量以及提取率的影響 在鹽酸丙酮體積比為3∶100，料液比為1∶5，醋酸鈉添加量為1%的條件下，由表4可以看出:攪拌時間在20min時所得的氯化血紅素的含量和提取率都較高，時間延長到25min時，則變化不明顯。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取鹽酸丙酮比、料液比、攪拌時間三個因素，采用正交設(shè)計(jì)表L9(34)進(jìn)行三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5，在分析過程中以氯化血紅素的含量與提取率為考察指標(biāo)。

表4 攪拌時間對氯化血紅素含量和提取率的影響Table 4 Effect of stirring time on hemin purity and yield

表5 工藝條件確定正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Orthogonal array design matrix and corresponding experimental results

由正交表5可知，各因素對氯化血紅素的含量的影響次序是A＞B＞C，即鹽酸丙酮的體積比＞料液比＞攪拌時間，其最優(yōu)水平為A3B3C3。各因素對氯化血紅素提取提取率的影響次序是A＞B＞C，即鹽酸丙酮的體積比＞料液比＞攪拌時間，最優(yōu)水平為A3B2C2。由于兩個考察指標(biāo)獨(dú)立分析后得出的最佳工藝條件不同，需要對它們影響的主次順序進(jìn)行綜合考慮以確定最后的最佳工藝，考慮到氯化血紅素的提取率與其含量和樣品的質(zhì)量相關(guān)，且呈正比關(guān)系，故以氯化血紅素的提取率為主要考慮因素。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對于因素B，即為料液比(v/v)為1∶5和1∶6時，2水平和3水平相差不大，考慮到有機(jī)試劑成本問題，選擇B2比較合適。綜合考慮，優(yōu)化的工藝條件是 A3B2C2，即鹽酸丙酮體積比為4∶100，酸性丙酮添加量為血渣體積的5倍，攪拌時間為20min。通過極差分析可得到因素C的R值小于空白列的R值，說明此因素對氯化血紅素含量這一指標(biāo)沒有顯著意義。

2.3 氯化血紅素的鑒定

2.3.1 產(chǎn)品性狀 所得產(chǎn)品肉眼觀察為黑褐色，反射光下為鋼藍(lán)色的粉末狀晶體，與參考文獻(xiàn)［10］報道的氯化血紅素性狀一致;不溶于水、稀酸、醚、氯仿、及丙酮，溶于氫氧化鈉水溶液、熱醇或氨水中，在水中穩(wěn)定，在有氧與光照條件下容易被破壞，與參考文獻(xiàn)［11］的報道一致。

2.3.2 顯色反應(yīng) 見圖1，左邊試管為血紅素標(biāo)準(zhǔn)樣品，右邊為樣品，可以看出兩個試管中溶液顏色都是淺棕色，外觀性質(zhì)一致，可以確定樣品為氯化血紅素。

圖1 氯化血紅素的顯色反應(yīng)Fig.1 Color yield properties of hemin

2.3.3 氯化血紅素的紫外掃描圖譜 從圖2可以看出，對照品和供試品紫外可見光譜基本一致，最大吸收峰為410nm，與文獻(xiàn)報道一致［12］，可以判定所提取的樣品為氯化血紅素。

圖2 氯化血紅素的紫外光譜圖Fig.2 The UV spectrum of hemin

2.4 氯化血紅素制備收率及含量

用優(yōu)化的工藝重復(fù)3次，純化后制備氯化血紅素，結(jié)果見表6。

表6 氯化血紅素提取率和收率Table 6 The purity and yield of hemin

2.5 氯化血紅素鐵含量檢測

分別采用國標(biāo)GB/T 5009.90－2003中原子吸收分光光度法以及磺基水楊酸顯色法對血紅素中鐵含量進(jìn)行檢測，其標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

所提樣品中鐵含量檢測及分析結(jié)果見表7。

圖3 原子吸收分光光度法測氯化血紅素中的鐵含量Fig.3 The detection of hemin’s iron content by atomic absorption spectrophotometric

圖4 氯化血紅素鐵含量檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of hemin iron content

表7 氯化血紅素成品鐵含量檢測Table 7 The detection of hemin’s iron content

從表7可見用原子吸收法所測得的鐵含量指標(biāo)比用分光光度法測得的數(shù)值偏高，考慮到原子吸收分光光度法法的精密度比分光光度法的高，并且省時，選擇原子吸收分光光度法為這一指標(biāo)的檢測方法。

3 結(jié)論與討論

3.1 血渣中提取血紅素的最佳工藝條件是A3B2C2，即鹽酸丙酮比為4∶100、料液比為1∶5、攪拌時間為20min，提取的血紅素含量可以達(dá)到98%以上，鐵含量7.8%以上，提取率達(dá)到60%以上，達(dá)到市場要求。此工藝方法易于操作、重復(fù)性好、所得產(chǎn)品含量高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

3.2 血紅素很不穩(wěn)定，容易被氧化成氯化血紅素，所以提取之前在血渣中添加少量的還原劑，可以防止血紅素在提取過程中被氧化，另外還可以將已經(jīng)被氧化的血紅素還原成亞鐵血紅素。血紅素在光照下不穩(wěn)定，因此整個提取過程應(yīng)盡量避免光照。

3.3 動物血球酶解制備血紅蛋白肽之后剩下的血渣富含血紅素，可以用來提取血紅素，且在提取工藝過程中丙酮使用率量較其他工藝大大減少，提取后剩下的雜蛋白經(jīng)過脫除有機(jī)溶劑處理又可以作為飼料銷售，增加了豬血附加值。

［1］宋照軍，張延生，劉璽，等.豬血中血紅素提取純化新技術(shù)研究［J］.肉類工業(yè)，2004，8(8):23－25.

［2］吳立芳.利用豬血制備氯化血紅素技術(shù)的研究［D］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［3］李志釗，葉春華.血紅素的應(yīng)用與生產(chǎn)技術(shù)研究進(jìn)展［J］.食品研究與開發(fā)，2000，10(20):12－14.

［4］張婷，莊紅，薛培宇.血紅素鐵功能及其二價鐵保護(hù)探索［J］.肉類研究，2008，3:18－20.

［5］Adrian R West，Phillip S Oates.Mechanisms of heme iron absorption:Current questions and controversies［J］.World J Gastroenterol，2008，14(26):4101－4110.

［6］劉任民，范萬東，王搖風(fēng)，等.豬血中高純度血紅素的提取工藝［J］.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)衛(wèi)生，2007，23(18):2687－2689.

［7］鐘耀廣.豬血中卟啉鐵的提取方法及血紅素修飾技術(shù)的研究［D］.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

［8］袁曦，洪清.氯化血紅素提取工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.藥品檢驗(yàn)，1997，32(6):360－362.

［9］王穎明，莫寶慶，徐濟(jì)達(dá)，等.豬血中血紅素提取條件的比較［J］.食品科技，2007，32(10):246－254.

［10］汪長國，戴亞，劉少民，等.超聲波酸性丙酮法制備氯化血紅素［J］.食品科學(xué)，2010，31(6):109－113.

［11］羅章，鄭立紅.血紅素色素制取及在肉品加工中的應(yīng)用［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2006，8(1):40－42.

［12］楊娟.利用豬血制備氯化血紅素及分析［D］.重慶:重慶大學(xué)，2008.