響應(yīng)面優(yōu)化酶解馬骨粉工藝的研究

秦娜娜，侯偉偉，張雙雙，李天蘭，李 可，楊海燕

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052)

目前，中國(guó)有馬近 892×104匹，居世界第一［1］。新疆有馬102.5×104匹，與內(nèi)蒙古(108.4×104匹)相近，居全國(guó)第二［2］。生馬骨中蛋白質(zhì)和脂肪含量分別為12.8%和8.5%，骨中含有構(gòu)成蛋白質(zhì)的所有氨基酸，且比例均衡、必需氨基酸水平高，屬于優(yōu)質(zhì)蛋白［3－4］。人們通過(guò)對(duì)酶解機(jī)理、酶解原料、酶及酶解液等方面進(jìn)行了大量的深入研究［5］，發(fā)現(xiàn)酶法水解優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在溫和，易控、有定向、反應(yīng)時(shí)間短，無(wú)環(huán)境污染，產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等。利用可控酶解技術(shù)水解骨蛋白，作為保健品的重要基料，具有良好的加工特性、營(yíng)養(yǎng)功能和生理活性，符合當(dāng)前消費(fèi)者對(duì)畜禽產(chǎn)品“天然、營(yíng)養(yǎng)、安全、健康”的消費(fèi)趨勢(shì)［6－8］。在國(guó)內(nèi)對(duì)骨的利用還停留在落后階段，只是將骨熬湯，制成骨膠等食品添加劑［9］。近些年隨著消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)變，“以骨補(bǔ)骨”的意識(shí)不斷增強(qiáng)，骨食品在研發(fā)方面取得了明顯的成績(jī)。在國(guó)外骨食品的開(kāi)發(fā)已經(jīng)很普遍，采用超微粉碎技術(shù)生產(chǎn)食用骨粉、骨糊、骨膠、骨漿、骨肉蛋白粉及骨提取物等各種骨產(chǎn)品及高質(zhì)量蛋白質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)以氮收率和水解度為指標(biāo)，在單因素基礎(chǔ)上，采用二次旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化最佳酶解工藝條件［10］。針對(duì)熏馬肉、熏馬腸中剩余副產(chǎn)物馬骨進(jìn)行綜合利用，形成具有較高副加值產(chǎn)品，這樣不僅可以減少骨資源的浪費(fèi)，獲得更大的經(jīng)濟(jì)效益，更重要的是通過(guò)加工工藝的改進(jìn)，豐富了消費(fèi)者食材。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生馬骨 新疆霍城縣馬產(chǎn)業(yè)基地;胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶 南寧龐博生物技術(shù)有限公司;正己烷、濃硫酸、氫氧化鈉 天津市福晨化學(xué)試劑廠;硫酸銅、硫酸鉀 天津市化學(xué)試劑三廠;甲基紅指示劑(C15H15N3O2)、溴甲酚綠指示劑(C21H14Br4O5S)等 均為分析純。

AL204－1C電子分析天平 梅特勒托利多儀器有限公司;HH－2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;凱氏定氮裝置 四川(崇州)蜀玻有限公司;TDL－5離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;pH計(jì) 德國(guó)Sartorius公司;PL3000真空冷凍干燥儀 Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水解度的測(cè)定方法 鄰苯二甲醛滴定法［11］。水解度(%)=水解液中的總游離氨基酸態(tài)氮含量/原料中的總氮量×100

1.2.2 氮收率的測(cè)定方法［12］根據(jù)公式計(jì)算氮收率:氮收率(%)=水解液中蛋白含量/原料中蛋白質(zhì)含量×100

1.2.3 工藝流程

1.2.4 酶種類的篩選 根據(jù)酶切位點(diǎn)的不同，分別采用堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶及胃蛋白酶在其各自的最適溫度、pH條件下，料液比 1∶6g/mL、加酶量 6000U/g、酶解時(shí)間 4h，對(duì)馬骨蛋白進(jìn)行水解，以水解度、氮收率來(lái)確定最佳用酶。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 確定酶解溫度、料液比、pH、加酶量、時(shí)間五個(gè)因素，對(duì)氮收率和水解度的影響。

1.2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box－Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，在酶解時(shí)間已經(jīng)確定的基礎(chǔ)上，以水解度為響應(yīng)值，選擇酶解溫度、料液比、pH、加酶量，進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)［10］。見(jiàn)表 1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The factor and level of test

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類的篩選結(jié)果

由圖1可知，馬骨粉未加酶的水解度和氮收率較低，添加酶后都有增加，其中堿性蛋白酶水解度、氮收率均最高，分別為:14.41%、68.25%，因此選擇堿性蛋白酶為水解用酶。5種不同蛋白酶對(duì)馬骨粉水解的影響順序?yàn)?堿性蛋白酶＞胃蛋白酶＞胰蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶。

圖1 酶種類的篩選Fig.1 Select about the types of the enzyme

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 溫度對(duì)酶解的影響 由圖2可知，隨著酶解溫度的增加水解度和氮收率都增加，50℃時(shí)數(shù)值最大，大于50℃其數(shù)值有顯著下降趨勢(shì)。因?yàn)?，低于酶的最適溫度，酶的活性比較小，高于酶的最適溫度會(huì)導(dǎo)致酶部分或全部失活，酶活力會(huì)迅速下降［13］。

圖2 溫度對(duì)酶解的影響Fig.2 The influence of temperature on enzymatic hydrolysis

2.2.2 料液比對(duì)酶解的影響 由圖3可知，馬骨粉酶解液的水解度和氮收率都是伴隨著料液比的不斷降低呈上升的趨勢(shì)，這主要是因?yàn)榱弦罕仍酱?，酶和底物接觸不充分，造成樣品中堿性蛋白質(zhì)酶解不完全。料液比越小，堿性蛋白酶和底物接觸的位點(diǎn)越充分，但是如果馬骨粉酶解液中可溶性的固形物含量太低，則不利于酶解液的冷凍干燥。因此，結(jié)合實(shí)際情況，選擇適宜的料液比為1∶6g/mL。

圖3 料液比對(duì)酶解的影響Fig.3 The influence of solid－liquid ratio on enzymatic hydrolysis

2.2.3 pH對(duì)酶解的影響 pH是影響酶活力的重要因素之一，因?yàn)槊敢l(fā)揮其催化功能，活性基團(tuán)部位必須有一定的解離形式。pH會(huì)影響酶分子的構(gòu)象和酶分子及底物的解離狀態(tài)，從而影響酶活性和酶促反應(yīng)速度，pH過(guò)高或過(guò)低都不利于酶解反應(yīng)。由圖4可知，pH為9時(shí)馬骨粉的水解度和氮收率最高。低于最適pH酶活力比較小，高于最適pH酶部分失活或全部失活，導(dǎo)致水解度和氮收率均下降［14］。

圖4 pH對(duì)酶解的影響Fig.4 The influence of pH on enzymatic hydrolysis

2.2.4 加酶量對(duì)酶解的影響 由圖5可知，隨著加酶量的增加，馬骨粉的氮收率和水解度在增加，低于6000U/g水解度和氮收率增加較快，高于6000U/g增加緩慢。隨著加酶量的增加，酶與底物不斷增加位點(diǎn)接觸，加酶量在6000U/g時(shí)，酶與底物的接觸位點(diǎn)已經(jīng)比較充分，再增加酶用量其水解度和氮收率變化不大，因此選擇最適的加酶量為6000U/g。

圖5 加酶量對(duì)酶解的影響Fig.5 The influence enzymatic hydrolysis of enzyme

2.2.5 時(shí)間對(duì)酶解的影響 由圖6可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度和氮收率顯著增加，4h時(shí)達(dá)最大值，大于4h趨于穩(wěn)定。因?yàn)槊附鈺r(shí)間過(guò)短，蛋白水解不完全，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白充分酶解，當(dāng)酶解達(dá)到最大，增加酶解時(shí)間不會(huì)增加水解程度。因此，選擇酶解時(shí)間為4h最佳。

圖6 時(shí)間對(duì)酶解的影響Fig.6 The influence of time on enzymatic hydrolysis

2.2.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果 運(yùn)用Design Expert8.0Trial設(shè)計(jì)，展開(kāi)29組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

根據(jù)表3所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，運(yùn)用Design Expert8.0 Trial統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，采用響應(yīng)曲面統(tǒng)計(jì)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，建立酶解溫度、料液比、酶解pH與加酶量四因子的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)回歸方程:

Y=18.40－2.63X1+0.53X2－0.092X3+0.7X4+0.55X1X2－0.42X1X3+0.15X1X4+0.72X2X3－1.62X2X4+0.13X3X4－2.26X12－1.72X22－2.31X32－1.75X42

進(jìn)一步對(duì)該回歸模型的顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)，響應(yīng)曲面的數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果見(jiàn)表3，分析結(jié)果顯示模型的 F=59.36＞F0.05(14，14)=2.48，p＜0.0001，表明回歸模型極顯著。失擬項(xiàng) F=1.92＜F0.05(14，10)=2.60，p=0.2776＞0.05，不顯著，說(shuō)明該模型擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小。因此，可以選擇用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)酶解法制取馬骨營(yíng)養(yǎng)多肽粉的工藝結(jié)果。同時(shí)一次項(xiàng) X1、X2、X4極顯著，交叉項(xiàng) X2X3、X2X4極顯著、X1X2顯著，平方項(xiàng)值都是極顯著性影響。最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果:酶解溫度47.1℃，料液比1∶6.98g/mL，酶解pH9.02，加酶量6180U/g。結(jié)合實(shí)際操作條件，酶解溫度 47℃，料液比1∶7g/mL，酶解 pH9，加酶量6200U/g，此時(shí)最大的水解度為17.8%。

表2 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The design and results of Box－Behnken

通過(guò)3組平行實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。所得酶解最大水解度平均值為17.47%(誤差值小于0.05%)。建立的模型比較符合實(shí)際情況，響應(yīng)面法優(yōu)化酶解馬骨粉工藝參數(shù)可行。

2.2.7 響應(yīng)曲面模型結(jié)果分析 通過(guò)對(duì)模型的響應(yīng)面以及相對(duì)應(yīng)的等高線圖進(jìn)行分析，得出各因素的交互作用對(duì)酶解的影響和預(yù)測(cè)最優(yōu)值，并對(duì)模型的預(yù)測(cè)最優(yōu)值進(jìn)行驗(yàn)證，從而確定預(yù)處理工藝酶解的最佳條件。模型的響應(yīng)曲面及其等高線見(jiàn)圖7～圖9。

響應(yīng)曲面出現(xiàn)最高點(diǎn)，在等高線面具有橢圓形中心區(qū)域，說(shuō)明因素在所選擇范圍內(nèi)能產(chǎn)生最佳的響應(yīng)值，因素的選擇在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)合理并且有效，能夠反映出響應(yīng)值的影響趨勢(shì)。響應(yīng)曲面坡度較大，未出現(xiàn)最高點(diǎn);在等高線面上具有部分橢圓形中心區(qū)域，表明具有交互作用，但無(wú)最佳響應(yīng)值。極值條件應(yīng)在等高線的橢圓圓心處。由圖7～圖9和表3可知，酶解溫度與料液比對(duì)馬骨脫脂中總蛋白質(zhì)含量的交互作用顯著，料液比與pH、料液比與加酶量的交互作用極顯著。

表3 回歸模型方差分析及模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 3 The Variance analysis and coefficients significant inspection of the model

圖7 Y=f(X1，X2)響應(yīng)曲面立體圖及等高線Fig.7 Response surface plot and contour map plot for Y=f(X1，X2)

圖8 Y=f(X2，X3)響應(yīng)曲面立體圖及等高線Fig.8 Response surface plot and contour map plot for Y=f(X2，X3)

3 結(jié)論

圖9 Y=f(X2，X4)響應(yīng)曲面立體圖及等高線Fig.9 Response surface plot and contour map plot for Y=f(X2，X4)

本實(shí)驗(yàn)以脫脂馬骨粉為原料，以水解度和氮收率為響應(yīng)值，對(duì)5種蛋白酶進(jìn)行比較，選擇堿性蛋白酶為水解用酶。在單因素的基礎(chǔ)上，通過(guò)二次旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化最佳酶解工藝參數(shù)為:酶解溫度47℃，料液比 1∶7g/mL，酶解 pH9，加酶量 6200U/g，酶解時(shí)間4h，在該條件下水解度為17.47%。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)可以看出，酶解法可以顯著提高馬骨粉水解度和增加馬骨粉綜合利用。

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