兩株紅酵母混合發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素及其影響因素

彭 鵬，劉園園，劉愛(ài)民，盧存龍，高 娜，馬 雪，李瑞萍

(安徽師范大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院生態(tài)環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;重要生物資源的保護(hù)和利用研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽蕪湖241000)

類胡蘿卜素在制藥、醫(yī)學(xué)、化妝品、食品和飼料產(chǎn)業(yè)中具有重要價(jià)值，其中的β－胡蘿卜素不僅是維生素A的前體，具有預(yù)防眼疾、保護(hù)視力的功能，而且還具有抑制細(xì)胞變異［1］，抗癌、防癌、抗氧自由基、增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，維護(hù)人體上皮組織的正常生理功能［2］，以及促進(jìn)兒童生長(zhǎng)發(fā)育、美容等一系列重要作用［3］，在世界許多國(guó)家被廣泛用作食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑及添加劑［4］。市場(chǎng)上目前存在合成β－胡蘿卜素和天然β－胡蘿卜素兩種［5－6］。合成 β－胡蘿卜素有致染色體畸變作用，在西方發(fā)達(dá)國(guó)家已被限制用作食品和飼料添加劑［7］。天然β－胡蘿卜素廣泛存在于黃色和綠色蔬果中，在某些動(dòng)物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)含有β－胡蘿卜素，其含量有很大差異。隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)天然β－胡蘿卜素產(chǎn)品市場(chǎng)需求的增加，采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)β－胡蘿卜素有廣闊的應(yīng)用前景［8－9］。國(guó)內(nèi)外對(duì)于β－胡蘿卜素發(fā)酵菌株的研究主要集中在三孢布拉氏霉(Blakeslea trispora)和紅酵母(Rhodotorula)。三孢布拉氏霉發(fā)酵產(chǎn)率雖然較高，但發(fā)酵技術(shù)工藝復(fù)雜、發(fā)酵周期長(zhǎng)、成本高，不易于產(chǎn)業(yè)化［10－11］。紅酵母生長(zhǎng)速率快、營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單，發(fā)酵工藝易于調(diào)控，菌體可綜合利用，且屬于我國(guó)飼料行業(yè)12種確認(rèn)的飼用微生物，易于進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)、具有很高的應(yīng)用價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景［10，12－13］。近年來(lái)，對(duì)紅酵母產(chǎn) β－胡蘿卜素研究已有相關(guān)報(bào)道。何海燕等人［14］以甘蔗糖蜜為碳源，經(jīng)搖瓶發(fā)酵初篩得到一株生物量和胡蘿卜素含量均較高的菌株 R3，發(fā)酵獲得胡蘿卜素含量0.767mg/g，胡蘿卜素產(chǎn)量為8.70mg/L，生物量達(dá)到11.34mg/L。梁曉華等人［15］在最適條件下?lián)u瓶培養(yǎng)Rhodotorula sp.hidai Y2，類胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到4.97mg/L。在紅酵母產(chǎn)β－胡蘿卜素的培養(yǎng)基優(yōu)化、發(fā)酵條件優(yōu)化及混菌發(fā)酵方面也有相關(guān)文獻(xiàn)。如，張志軍等人［16］研究發(fā)現(xiàn)蔗糖和葡萄糖作為碳源，對(duì)海洋紅酵母(Rhodotorula sp.06)的生長(zhǎng)和色素的產(chǎn)生最有利，麥芽糖次之，乳糖的生物量最低。Tinoi等人［17］利用綠豆渣作為原料類胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到了2.48mg/L。Buzzini［18］優(yōu)化了一株紅酵母的培養(yǎng)條件，類胡蘿卜素含量達(dá)到803.2μg/g，他還應(yīng)用分批補(bǔ)料方法，將粘紅酵母DBVPG3853與巴德利酵母DBVPG3503共同培養(yǎng)，玉米漿為唯一碳源，結(jié)果測(cè)得色素產(chǎn)量為 8.2mg/L［19］。本文在對(duì)粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)31229和一株產(chǎn)β－胡蘿卜素量較高的紅酵母菌株RY－01進(jìn)行了初步研究的基礎(chǔ)上，探討其混合發(fā)酵的培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件，并考察幾種促進(jìn)劑對(duì)混合發(fā)酵中的β－胡蘿卜素產(chǎn)量和生物量的影響，為β－胡蘿卜素高產(chǎn)菌株的選育和β－胡蘿卜素的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粘紅酵母(Rhodotorula glutinis) 編號(hào)31229，購(gòu)自CICC中心;紅酵母RY－01 微生物實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

UV－2000型紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì) UNICO公司;JC202型電熱恒溫干燥箱 上海成順儀器儀表公司;HYQ－150型生物搖床 武漢匯成生物科技公司;HH－1型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市億通電子公司;TDL－40B型低速臺(tái)式大容量離心機(jī) 無(wú)錫瑞江分析儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法 菌種活化培養(yǎng)基:麥芽汁培養(yǎng)基［20］;斜面培養(yǎng)基:采用 PDA 培養(yǎng)基［20］;種子培養(yǎng)基:采用PDA液體培養(yǎng)基，裝液量為100mL/250mL三角瓶;起始發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏10g，加水至1000mL，pH6.0，裝液量為30mL/250mL三角瓶;優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基:麥芽糖20g，蛋白胨10g，酵母膏10g，加水至1000mL，pH6.0，裝液量為30mL/250mL三角瓶。

種子擴(kuò)培方法:從斜面上挑取兩環(huán)菌種，接入種子培養(yǎng)基中，混合種子液為粘紅酵母和紅酵母RY－01各挑一環(huán)接入種子培養(yǎng)基。30℃，180r/min，搖床培養(yǎng)24h。

1.2.2 菌體生物量的測(cè)定 取10mL發(fā)酵液，4000r/min離心15min，棄上清，用蒸餾水洗滌2次;用蒸餾水將菌體移入預(yù)先干燥至恒質(zhì)量M0的稱量瓶中，置60℃電熱恒溫干燥箱中，干燥至恒質(zhì)量，用精密電子天平稱量稱量瓶與菌體總質(zhì)量M［21］。

細(xì)胞生物量公式為:W=1000×(M－M0)/10

式中:W－細(xì)胞生物量，g/L;M－稱量瓶與菌體的總質(zhì)量，g;M0－稱量瓶的質(zhì)量，g。

1.2.3 β－胡蘿卜素的提取與測(cè)定 酸熱破壁法破酵母細(xì)胞壁，參考文獻(xiàn)［11，22］，轉(zhuǎn)速為4000r/min。

β－胡蘿卜素的提取與測(cè)定方法，參考文獻(xiàn)［21］，提取溶劑為丙酮，用紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)450nm下測(cè)定吸光度值。

β－胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算公式為:Wc=Aλmax×D×V/0.16m

式中:Wc－發(fā)酵液β－胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，μg/g干菌體;Aλmax－最大吸收波長(zhǎng)450nm下的吸光度;D－測(cè)定試樣的稀釋倍數(shù);V－提取色素用有機(jī)溶劑體積，mL;m－干酵母菌體質(zhì)量，g;0.16－β－胡蘿卜素的摩爾消光系數(shù)，(mol× cm)－1。

β－胡蘿卜素產(chǎn)量(μg/L)=β－胡蘿卜素含量(μg/g)×細(xì)胞生物量(g/L)

1.2.4 實(shí)驗(yàn)方法 單菌發(fā)酵與混合發(fā)酵的比較:將粘紅酵母、紅酵母RY－01和混合種子液按接種量10%分別接入起始發(fā)酵培養(yǎng)基，置于 30℃，180r/min，搖床培養(yǎng)4d后分別測(cè)定生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量。

混合發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間實(shí)驗(yàn):將混合種子液按接種量10%接入優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，于30℃，180r/min，搖床培養(yǎng)。分別在培養(yǎng) 1、2、3、4、5、6d 后測(cè)定菌體生物量和β－胡蘿卜素含量。

混合發(fā)酵碳源實(shí)驗(yàn):培養(yǎng)基為2%碳源，1%氯化銨，0.02%磷酸氫二鉀，0.02%硫酸鎂，pH6.0，裝液量為30mL/250mL三角瓶。以葡萄糖為對(duì)照，其他碳源分別為乳糖、半乳糖、淀粉、麥芽糖、甘露醇、甜醇、木糖和吐溫－80。將混合種子液按接種量10%接入培養(yǎng)基，于30℃，180r/min，搖床培養(yǎng)4d后分別測(cè)定生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量。

混合發(fā)酵氮源實(shí)驗(yàn):培養(yǎng)基為2%麥芽糖，1%氮源，0.02%磷酸氫二鉀，0.02%硫酸鎂，pH6.0，裝液量為30mL/250mL三角瓶。以氯化銨為對(duì)照，其他氮源分別為蛋白胨、硝酸鉀、尿素和硝酸銨。將混合種子液按接種量10%接入培養(yǎng)基，于30℃，180r/min，搖床培養(yǎng)4d后分別測(cè)定生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量。

混合發(fā)酵無(wú)機(jī)鹽實(shí)驗(yàn):以優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加硫酸鉀、硫酸鎂、硫酸銨。設(shè)置的濃度梯度為 0.3%、0.5%、0.7%、1.0%，調(diào)整pH6.0。將混合種子液按接種量10%接入培養(yǎng)基，于30℃，180r/min，搖床培養(yǎng)4d后分別測(cè)定生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量。

混合發(fā)酵中促進(jìn)劑的影響:在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加檸檬酸三鈉和橘子皮干粉浸汁，調(diào)整pH6.0。檸檬酸三鈉濃度梯度設(shè)置為0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%;取橘子皮干粉 10g，加水 50mL，50℃水浴1h后四層紗布過(guò)濾，定容至50mL，分別按體積比2%、4%、6%、8%、10%加入優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中。將混合種子液按接種量10%接入培養(yǎng)基，于30℃，180r/min，搖床培養(yǎng)4d后分別測(cè)定生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩株紅酵母的形態(tài)

由圖1可知，紅酵母菌株RY－01和粘紅酵母31229不論在菌落形態(tài)和顯微形態(tài)上，兩者差異都很明顯，紅酵母菌株RY－01菌落較大，色深，菌體呈近圓形;粘紅酵母31229菌落較小，色較淺，菌體呈橢圓狀。

圖1 兩株紅酵母在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)(a)和顯微形態(tài)(10x40)(b)Fig.1 The colony in PDA culture medium(a)and micrograph morphology(10x40)(b)of two Rhodotorula Strains

2.2 單菌發(fā)酵與混合發(fā)酵結(jié)果

由圖2可知，在30℃，180r/min，搖床培養(yǎng)4d后，紅酵母RY－－01和混合菌的菌體生物量均高于粘紅酵母，分別為24.19g/L和23.56g/L;與單菌發(fā)酵相比，混合發(fā)酵所得到的β－胡蘿卜素產(chǎn)量顯著提高，達(dá)到 8837.83μg/L。高于 Buzzini利用粘紅酵母DBVPG3853與巴德利酵母DBVPG3503混菌發(fā)酵所得的類胡蘿卜素產(chǎn)量 8.2mg/L［18］。

圖2 不同菌種發(fā)酵的菌體生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量Fig.2 Biomass and β－carotene production from different strains

2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)混合發(fā)酵菌體生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量的影響

由圖3可知，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)混合發(fā)酵的菌體生物量和β－胡蘿卜素含量有很大影響。在30℃，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min的條件下培養(yǎng)1d時(shí)，用分光光度計(jì)檢測(cè)不到β－胡蘿卜素，菌體生物量在第3d時(shí)達(dá)到最大值，為15.52g/L;菌體中β－胡蘿卜素產(chǎn)量則在培養(yǎng)4d時(shí)達(dá)到最高值，為2081.25μg/L。而到培養(yǎng)5d時(shí)，菌體生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量均急劇下降。因β－胡蘿卜素是紅酵母的次生代謝產(chǎn)物，其含量的積累與菌體生物量的積累并不同步，在時(shí)間上有一定的滯后性，主要在菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定期產(chǎn)生。

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on biomass and β－carotene production

2.4 碳源對(duì)混合發(fā)酵菌體生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量的影響

從圖4可以看出，兩株紅酵母混合發(fā)酵的最適碳源為麥芽糖。在30℃，180r/min，搖床培養(yǎng)4d后，以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基中生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量均最高，分別為8.62g/L和1437.50μg/L。在本實(shí)驗(yàn)中，為了排除天然物的影響，未使用最佳氮源，同時(shí)缺少酵母需要的生長(zhǎng)因子，采用合成培養(yǎng)基，故而生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量明顯偏低。

圖4 碳源對(duì)菌體生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Table 4 Effect of carbon source on biomass and β－carotene production

2.5 氮源對(duì)混合發(fā)酵菌體生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量的影響

由圖5可以明顯看出，蛋白胨是兩株紅酵母混合發(fā)酵的最適氮源。在30℃，180r/min，搖床培養(yǎng)4d后，在蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量顯著高于其他氮源培養(yǎng)基，達(dá)到23.80g/L和5225.0μg/L。而在尿素為氮源的培養(yǎng)基中生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量最低，為4.58g/L和37.50μg/L。

2.6 無(wú)機(jī)鹽對(duì)混合發(fā)酵菌體生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量的影響

圖5 氮源對(duì)菌體生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of nitrogen source on biomass and β－carotene production

從圖6－a和圖6－b可知，總體而言，無(wú)機(jī)鹽的使用對(duì)混合發(fā)酵中菌體生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量有一定的影響作用。隨著K+濃度的上升，菌體生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，當(dāng)硫酸鉀為0.3%時(shí)最高，為12.07g/L和2703.13μg/L，略高于對(duì)照組;隨著Mg2+濃度的上升，菌體生物量先增后減，在硫酸鎂濃度0.7%時(shí)最高，為12.15g/L，而β－胡蘿卜素產(chǎn)量在硫酸鎂濃度1.0%時(shí)達(dá)到2734.38μg/L，略高于對(duì)照組;NH+4濃度的增加對(duì)菌體生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量均有一定的促進(jìn)作用，但低于對(duì)照組。

圖6 無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌體生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of inorganic salt on biomass and β－carotene production

2.7 促進(jìn)劑對(duì)混合發(fā)酵菌體生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量的影響

由圖7可知，在30℃，180r/min，搖床培養(yǎng)4d后，檸檬酸三鈉濃度為0.4%時(shí)菌體生物量達(dá)到16.57g/L，隨著濃度的升高，菌體生物量的略有遞減，趨勢(shì)不大;與菌體生物量相反，檸檬酸濃度為1.2%時(shí)β－胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到最大值2643.75μg/L，并且隨著濃度的增加，呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)。表明檸檬酸濃度為1.2%時(shí)對(duì)菌體產(chǎn)β－胡蘿卜素的量有一定促進(jìn)作用。由圖8可知，橘子皮干粉浸汁為6%時(shí)菌體生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量均達(dá)到最高，分別為16.57g/L和3868.75μg/L，并且隨著浸汁使用量的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。β－胡蘿卜素是紅酵母生長(zhǎng)過(guò)程中的次生代謝產(chǎn)物，一些前體物質(zhì)的使用對(duì)紅酵母產(chǎn)β－胡蘿卜素有一定的促進(jìn)作用。實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組的菌體生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量為11.73g/L和2531.25μg/L，檸檬酸三鈉和橘皮干粉浸汁對(duì)菌體生物量有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，橘皮浸汁對(duì)β－胡蘿卜素產(chǎn)量的促進(jìn)作用比檸檬酸三鈉效果更明顯。

圖7 檸檬酸三鈉對(duì)菌體生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of trisodium citrate on biomass and β－carotene production

圖8 橘皮粉浸汁對(duì)菌體生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of orange peel powder extract on biomass and β－carotene production

3 結(jié)論

3.1 粘紅酵母和紅酵母RY－01混合發(fā)酵，在30℃，180r/min，搖床培養(yǎng)4d后，菌體生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到23.56g/L和8.8mg/L。比Buzzini利用粘紅酵母DBVPG3853與巴德利酵母DBVPG3503混菌發(fā)酵所得的類胡蘿卜素產(chǎn)量8.2mg/L要高。

3.2 碳源、氮源的選擇對(duì)混合發(fā)酵的菌體生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量有很大影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，粘紅酵母和紅酵母RY－01混合發(fā)酵的最適碳源是麥芽糖，最適氮源為蛋白胨;K+和Mg2+的使用對(duì)混合發(fā)酵有一定的促進(jìn)作用，但效果不顯著。與對(duì)照組相比，硫酸鉀濃度為0.3%時(shí)，菌體生物量和β－胡蘿卜素產(chǎn)量分別提高了2.8%和6.8%;當(dāng)硫酸鎂濃度0.7%時(shí)，菌體生物量提高了3.6%，當(dāng)濃度為1.0%時(shí)β－胡蘿卜素產(chǎn)量提高了8.0%。

3.3 β－胡蘿卜素是紅酵母生長(zhǎng)過(guò)程中的次生代謝產(chǎn)物，其含量的積累與生物量的積累并不同步，在時(shí)間上有一定的滯后性。培養(yǎng)基中添加適量的代謝前體物質(zhì)，有利于β－胡蘿卜素的積累。本實(shí)驗(yàn)中，添加6%的橘皮干粉浸汁后，混合發(fā)酵的菌體生物量和β－胡蘿卜素的比對(duì)照組分別提高了41.3%和52.8%。

本實(shí)驗(yàn)采用了兩種不同紅酵母混合發(fā)酵，探討其混合發(fā)酵的培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件，并考察了檸檬酸三鈉和橘皮干粉浸汁兩種促進(jìn)劑對(duì)混合發(fā)酵中的β－胡蘿卜素產(chǎn)量和生物量的影響，為β－胡蘿卜素高產(chǎn)菌株的選育和β－胡蘿卜素的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

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