關(guān)于PCR儀基座溫度校準(zhǔn)點選擇的探討

方榮瑞

(蕪湖市計量測試研究所,蕪湖 241007)

0 引言

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的在短時間內(nèi)體外大量擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)[1]。溫度控制作為PCR儀中一個關(guān)鍵技術(shù)，它的準(zhǔn)確性直接影響到擴(kuò)增的結(jié)果。由于PCR儀基座形狀復(fù)雜，如圖1所示，影響其控溫精度和溫場分布因素很多[2]。對PCR溫度研究都是通過各個單點出發(fā)，通過比較特征點溫度與設(shè)定值的差異來評估儀器控溫精度，對比特征值之間的溫差來評估溫場均一性等[3,4]。對于96孔基座接入96根溫度傳感器進(jìn)行溫度實時采集，最能真實的反應(yīng)出基座的溫度場，然而卻太費物力，也大大加重了計算量。因此，選擇溫度校準(zhǔn)特征點是我們開展溫度校準(zhǔn)的前提工作。目前，特征點的選擇一般都是根據(jù)基座形狀的對稱性，考慮邊緣效應(yīng)和空氣對流等因素憑經(jīng)驗和常識來確定的，不具有科學(xué)性，當(dāng)選擇的特征點處于同一高或低溫度區(qū)域時，勢必會導(dǎo)致對PCR儀器溫度性能指標(biāo)評估的偏差。文中運用solidworks自帶仿真軟件，對PCR儀基座進(jìn)行仿真模擬，劃分不同溫區(qū)，確定特征點，并加以實驗驗證。為今后開展PCR分析儀器熱循環(huán)系統(tǒng)校準(zhǔn)工作提供參考。

圖1 PCR儀基座示意圖

1 PCR儀熱循環(huán)系統(tǒng)

PCR儀的核心是鋁制或不銹鋼的樣品塊，其上陣列式地分布著數(shù)量不等的PCR反應(yīng)試管插孔，將封裝有反應(yīng)液的反應(yīng)試管插入到插孔中進(jìn)行PCR反應(yīng)。如圖2所示，在樣品塊下端均勻貼合著幾片相互串聯(lián)相接的基于Peltier效應(yīng)的半導(dǎo)體制冷片(thermoelectric cooler，TEC)，完成快速升降溫功能。在PCR儀翻蓋或滑蓋內(nèi)側(cè)有塊尺寸與基座一致的金屬熱蓋。反應(yīng)時，熱蓋壓下，作用于反應(yīng)試管頂部的壓力，使得試管和插孔更緊密的結(jié)合，且熱蓋在反應(yīng)過程中始終保持在100℃左右，防止試管內(nèi)樣品蒸發(fā)后在試管頂部形成冷凝水，影響反應(yīng)結(jié)果[5]。

圖2 半導(dǎo)體式PCR儀結(jié)構(gòu)示意圖

2 傳熱建模及仿真

PCR儀按照事先設(shè)定好的循環(huán)程序，快速升降到設(shè)定溫度值并保持一段時間，此時，通過平鋪在基座下面的幾片半導(dǎo)體制冷片傳入系統(tǒng)的熱量正好等于基座同儀器外殼及外界大氣傳出的熱量，從而這段時間里PCR儀基座與周圍環(huán)境進(jìn)入了一個穩(wěn)態(tài)導(dǎo)熱階段，這是一個常物性、無熱源、穩(wěn)態(tài)的三維導(dǎo)熱問題，導(dǎo)熱方程如式(1)：

(1)

對一臺Mycycler型號的PCR儀的96孔基座實體建模如圖1所示。模型長106.12mm、寬70.12mm、高14.7mm，內(nèi)有96個PCR反應(yīng)槽，以8行12列的陣列均勻分布。各個反應(yīng)插孔之間相互孤立，大大減小了反應(yīng)基座的熱容，從而增加了PCR過程中的升降溫速率。反應(yīng)管采用的是標(biāo)準(zhǔn)的0.2mL的PP管。由于基座形狀的對稱性，在仿真時，選取基座的四分之一加以模擬即可。

2.1 基座下表面邊界條件

PCR儀基座下表面均勻的平鋪著幾片半導(dǎo)體制冷片，在制冷片與基座之間涂有一層很薄的導(dǎo)熱膠，使基座下表面受熱更為均勻。當(dāng)加熱到設(shè)定溫度穩(wěn)定后，基座下表面將保持在恒定溫度，故施加第一類邊界條件。

2.2 基座上表面邊界條件

金屬熱蓋在PCR反應(yīng)過程中始終保持在100℃左右。熱蓋與基座之間存在通過PP反應(yīng)試管的熱傳導(dǎo)和空氣對流傳熱，由于位于熱蓋和基座之間的空氣的溫度和熱蓋溫度基本相同，故可以忽略空氣對流傳熱。且PP反應(yīng)試管的熱導(dǎo)率系數(shù)很小，故通過反應(yīng)試管熱傳導(dǎo)到基座上表面的熱量可忽略不計。在仿真基座溫度分布時，將上表面設(shè)為絕熱條件。

2.3 基座側(cè)面邊界條件

PCR儀進(jìn)入穩(wěn)態(tài)傳熱時，基座底部的半導(dǎo)體制熱/制冷片流入到基座系統(tǒng)的熱量正好等于基座側(cè)壁和插孔跟外界空氣熱傳導(dǎo)損失的熱量。所以側(cè)壁的邊界條件可以表示為：

(2)

式中：tw為基座的溫度；tf為周圍空氣的溫度；h為對流換熱系數(shù)；l為熱傳導(dǎo)系數(shù)；n為側(cè)壁的法向方向。

多次試驗結(jié)果顯示：當(dāng)設(shè)定值為與室溫溫差最大的94℃時，PCR基座的邊緣效應(yīng)最明顯，基座均勻性最差。選擇變性溫度時的穩(wěn)態(tài)基座溫場加以仿真分析。經(jīng)過傳熱計算可得基座換熱系數(shù)[6,7]：

h94℃=11.71(W/m2·K)

為了減小熱損失，越來越多PCR儀基座側(cè)壁都加有一層保溫層，從而隔絕了樣品基座與外界空氣的直接接觸，由于保溫層傳熱系數(shù)很低，保溫層外側(cè)的溫度和外界空氣溫度相近，故在仿真試驗時只需在外側(cè)壁面施加第一類邊界條件即室溫即可。仿真實驗中對保溫層外壁加載室溫的第一類邊界條件室溫23℃，可以忽略側(cè)壁空氣對流對基座的影響。

2.4 仿真結(jié)果

對四分之一塊基座進(jìn)行實體網(wǎng)格劃分，運用以上所述的邊界條件對模型加載，最后得到其仿真結(jié)果如圖3所示。

圖3 四分之一個基座穩(wěn)態(tài)溫度分布圖

3 實驗驗證及結(jié)論

利用keithley2000配合T型熱電偶搭建的測溫系統(tǒng)對Mycycler型號PCR儀基座個別插孔進(jìn)行檢測，并與仿真結(jié)果加以對比，結(jié)果如表1所示。

表1PCR儀基座插孔溫度檢測數(shù)據(jù)表 ℃

由表1可知，在基座四周加上保溫層，明顯改善了基座溫度場分布的均勻性。在同加保溫層的情況下，實測溫度比仿真溫度略高，廠家在設(shè)計產(chǎn)品時，考慮到儀器使用環(huán)境的空氣流動會加強(qiáng)對流換熱，從而適當(dāng)?shù)膶υO(shè)定溫度實際值進(jìn)行了修正，使得實際溫度能滿足生化反應(yīng)的溫度需求。PCR儀基座溫度趨勢為：中間位置反應(yīng)插孔的溫度最高，PCR基座靠近側(cè)壁的反應(yīng)插孔的溫度比中間的反應(yīng)插孔的溫度低，尤其是拐角的那個插孔溫度最低，實測與仿真得到的溫度變化趨勢是一致的。

為了進(jìn)一步闡明基座的溫場分布，利用搭建的測溫系統(tǒng)對某一PCR儀基座反應(yīng)試管插孔逐一進(jìn)行了溫度在線檢測，其基座溫場等溫線示意圖如圖4所示，基座中心區(qū)域的溫度均勻，邊緣插孔的溫度略低于中心區(qū)域(<0.4℃)，并且具有很好的對稱性。

圖4 某一PCR儀基座等溫線示意圖(℃)

分析了基座各孔的仿真溫度、實際溫度分布，并結(jié)合在PCR儀實際使用中四個拐角一般都放上空的反應(yīng)試管起支撐作用這一情況以及基座結(jié)構(gòu)特征和空氣對流等因素考慮后，選用12路溫度傳感器分別布置在PCR儀基座不同溫度區(qū)域，采集基座試管孔的溫度信號，具體的溫度校準(zhǔn)特征點分布如圖5所示。

圖5 溫度檢測點分布圖

國內(nèi)尚沒有PCR儀溫度檢定規(guī)程和校準(zhǔn)規(guī)范，本論文研究只是一次探索，還需協(xié)同國內(nèi)相關(guān)的研究機(jī)構(gòu)，特別是計量研究部門、生產(chǎn)廠家等，盡早建立一套完善的PCR儀溫度校準(zhǔn)體系。

[1] Ji Youn Lee，Hee-Woong Lim,et al.Simulation and real-time monitoring of polymerase chain reaction for its higher efficiency[J].Biochemical Engineering Journal，29(2006):109～118

[2] 黃靖、陳章位，等.定量PCR儀熱循環(huán)系統(tǒng)溫度均勻性有限元仿真研究[J].儀器儀表學(xué)報,2010,31(5):1142-1146

[3] 張文超.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)與基因擴(kuò)增分析儀器(PCR儀)[J].生命科學(xué)儀器,2005,3(3):13-19

[4] Liu Jun，Weijun，Tianran Wang.Research and Realization of Algorithms for Gene-chip PCR Temperature-Tracking Control[C].The Ninth International Conference on Electronic Measurement & Instruments， 2009：3946-3949

[5] 薛生虎,李東升，等.基于多傳感器融合技術(shù)的PCR儀溫度校準(zhǔn)系統(tǒng)[J].儀器儀表學(xué)報,2011,32(6):1232-1236

[6] 楊世銘，陶文銓，等.傳熱學(xué)[M] (第2版).北京：高等教育出版社，2006，43-76

[7] Yang S M，Zhang Z Z.An experiental study of natural convection heat transfer from a horizontal cylinder in high Rayleigh number laminar and turbulent region[C]//Hewitt G F .Proceedings of the 10th International Heat Transfer Conference.Brighton，1994，7：108-189