白蟻mtDNA提取方法改良及檢測(cè)

姜麗紅, 鄒湘武, 寧滌非, 席在星

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白蟻mtDNA提取方法改良及檢測(cè)

姜麗紅*1, 鄒湘武1, 寧滌非1, 席在星2

(1. 常德市白蟻防治所, 湖南 常德, 415000; 2. 湖南文理學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 湖南 常德, 415000)

利用mtDNA多態(tài)性進(jìn)行種類鑒定是一種分子生物學(xué)常用方法, 從DNA水平對(duì)白蟻進(jìn)行物種鑒別并探討物種的進(jìn)化, 其必要前提是提取到一定數(shù)量和質(zhì)量的mtDNA. 在分離得到線粒體后, 分別采用CTAB、SDS 2種方法提取mtDNA. 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度及濃度, 用mtDNA 特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增檢測(cè). 試驗(yàn)證明2種方法均能成功提取白蟻的mtDNA, SDS法提取效果較好.

白蟻; mtDNA提取; CTAB; SDS

白蟻(), 亦稱蟲尉, 屬節(jié)肢動(dòng)物門, 昆蟲綱, 等翅目, 屬于較低級(jí)的半變態(tài)昆蟲[1]. 白蟻體軟而小, 通常長(zhǎng)而圓, 白色、淡黃色、赤褐色直至黑褐色. 主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū), 以木材或纖維素為食. 全世界已知白蟻種類約3 000余種. 根據(jù)黃復(fù)生記述, 除了澳白蟻科沒(méi)有發(fā)現(xiàn)外, 中國(guó)白蟻隸屬4科44屬476種[1], 其中散白蟻屬種類最多, 超過(guò)100種. 白蟻分布范圍很廣, 約占全國(guó)陸地總面積的35%～40%.

線粒體DNA是染色體核外遺傳物質(zhì), 動(dòng)物線粒體DNA(mtDNA)為共價(jià)閉合環(huán)狀的雙鏈DNA[2],分子量為15～18 kb, 屬于單倍體, 且具有相對(duì)自主性, 變異快, 結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單, 經(jīng)母系遺傳, 對(duì)真核生物基因組的結(jié)構(gòu)、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、調(diào)控機(jī)理等方面都起著重要作用. 近年來(lái)被廣泛用于近緣種間或種內(nèi)種群間親緣關(guān)系的研究.

本研究比對(duì)分析了用CTAB法和SDS法提取mtDNA技術(shù), 用mtDNA 特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增檢測(cè), 以期找到提取白蟻mtDNA最佳方法.

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

飽和酚、氯仿、EDTA、Tris、CTAB、SDS、瓊脂糖, 引物由生工生物工程有限公司合成, PCR試劑盒, 紫外分光光度計(jì), PCR儀, 電泳儀, 凝膠成像分析系統(tǒng).

1.2 樣本

白蟻標(biāo)本采集于常德市河洑森林公園、德山公園. 采回后存放于-80 ℃冰箱備用.

1.3 線粒體的獲取

a. 取10頭新采集的白蟻, 去腹部, 于1.5 mL Eppendor管中加液氮研磨, 再轉(zhuǎn)入玻璃勻漿器加1 mL冷勻漿液勻漿, 隨即以3 000 rpm、4℃離心3 min[2]; b. 取上清, 10 000 rpm, 4 ℃離心10 min, 沉淀即為粗線粒體.

1.4 mtDNA 的提取

1.4.1 CTAB法

a. 取粗線粒體移入1.5 mL Eppendorf管中; b. 加入800 μL 65 ℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液, 混勻, 每5 min輕輕震蕩幾次, 20 min后12 000 rpm離心15 min; c. 小心吸取上清液, 加入等體積的酚和氯仿(各400 μL)溶液, 混勻, 4 ℃、12 000 rpm離心10 min; d. 小心吸取上清液, 加入等體積的氯仿, 混勻, 4 ℃、12 000 rpm離心10 min; e. 重復(fù)步驟d 1～2次, 以蛋白層不出現(xiàn)為止; f. 取上清,-20 ℃沉淀1 h, 4 ℃、12 000 rpm離心10 min; g. 棄去上清液, 用70%乙醇洗滌沉淀2次; h. 室溫下干燥后(一般干燥30 min), 溶于30～50 μL去離子水中, 于－20 ℃下保存?zhèn)溆肹3].

1.4.2 SDS法

a. 將線粒體溶于100 mL(50 mmol/l葡萄糖、10 mmol/L Na2EDTA、25 mmol/L Tris-HCl, pH8.0)溶液中, 充分混勻; b. 加200 ml新鮮配制的(1%SDS, 0.2 N NaOH)溶液, 輕輕搖勻, 冰浴5 min[4]; c. 再加150 mL 3 M NaAc(pH4.8)溶液, 輕輕搖勻, 冰浴5 min, 12 000 rpm離心10 min; d. 取上清加等體積酚、氯仿、異戊醇(體積比為25:24:1)溶液, 抽提2～4次, 界面無(wú)白色物質(zhì), 12 000 rpm離心10 min; e. 取上清加2倍體積95%乙醇, 室溫靜置15 min, 然后12 000 rpm離心10 min; f. 棄上清, 沉淀用75%乙醇洗滌1次, 以12 000 rpm離心5 min; g. 棄上清, 取沉淀, 真空干燥后得線粒體DNA. 將其溶于適量的TE緩沖液中, －20 ℃保存?zhèn)溆肹5].

1.5 DNA濃度和純度檢測(cè)

使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè). 用100 μL TE 溶液作空白對(duì)照, 取所提取的mtDNA 1 μL 加入99 μL TE 中, 檢測(cè)樣本不同波長(zhǎng)的光密度值(OD), 并計(jì)算OD260/OD280值和質(zhì)量濃度.

1.6 凝膠電泳檢測(cè)

1.0%瓊脂糖凝膠, 5 μLmtDNA 樣品混合1 μL溴酚藍(lán), 5 V/cm電泳40 min, 置于凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并拍照.

1.7 16 S rRNA gene部分序列PCR擴(kuò)增

1.7.1 引物

采用Husseneder C等[6]設(shè)計(jì)的白蟻mtDNA 16S rRNA gene引物序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 其上游引物 5’-TTACGCTGTTATCCCTAA-3’, 下游引物 5’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’.

1.7.2 PCR擴(kuò)增體系及程序

按表1和圖1進(jìn)行PCR擴(kuò)增.

表1 PCR體系 /μL

圖1 PCR擴(kuò)增程序

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA純度檢測(cè)及分析

在紫外分光光度計(jì)下檢測(cè)mtDNA的純度和濃度, 檢測(cè)結(jié)果見表2. 測(cè)定結(jié)果表明OD260/OD280的光吸收比值均在1.7～2.0之間, 說(shuō)明無(wú)蛋白質(zhì)和酚的污染, 符合PCR的要求[2]. 從表2可知, SDS法提取白蟻mtDNA純度和濃度都明顯高于CTAB法. 經(jīng)純化后, OD260/OD280都達(dá)到了1.85以上, 完全符合RLFP的要求[7].

表2 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果

2.2 電泳檢測(cè)結(jié)果及分析

取5 μLmtDNA 樣品混合1 μL溴酚藍(lán), 0.8%瓊脂糖凝膠80 V電泳40 min, 電泳圖見圖2. 4條泳道都能看到mtDNA, 大小在17 kb左右, 與邢連喜[6]等研究的散白蟻mtDNA分子量結(jié)果基本相吻合. 泳道上方還有一條帶, 大小在40 kb左右, 應(yīng)該為總DNA. 其中泳道1和2是CTAB法電泳結(jié)果, 條帶較暗; 泳道3和4是SDS法電泳結(jié)果, 條帶明亮. 由圖2可知, SDS法提取的DNA豐度較大, 且蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)較少; 而CTAB法提取的DNA量較少, 有蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)污染, 故用SDS法提取較優(yōu).

圖2 mtDNA電泳圖. 1—CTAB法; 2— CTAB 法純化后; 3— SDS法; 4— SDS法純化后

圖3 PCR結(jié)果電泳圖

2.3 PCR檢測(cè)結(jié)果及分析

對(duì)2種不同提取方法得到的白蟻mtDNA 對(duì)其16 S rRNA gene進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 電泳結(jié)果如圖3. 由圖3可知, 2種不同提取方法得到的白蟻mtDNA都能得到430 bp左右的條帶, 與張衛(wèi)東等研究的6種乳白蟻的16 S rRNA序列長(zhǎng)度結(jié)果基本相吻合[8], 證明提取結(jié)果正確.

3 小結(jié)與討論

不同物種其核酸提取方法各不相同. CTAB是一種陽(yáng)離子去污劑, 具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性. 其特點(diǎn)是去除多糖和酚類物質(zhì)的效果較好, 故常用于植物核酸的提取, 但因此核酸也有部分損失, 其提取的豐度較少. 而SDS是一種陰離子去污劑, 易與疏水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀, 故常用于動(dòng)物核酸的提取. 因此, SDS法更適合提取白蟻mtDNA.

本文就白蟻mtDNA 的提取技術(shù)在前人的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良, 主要體現(xiàn)在提取之前的線粒體分離處理、粗提后的純化和PCR鑒定. 線粒體的分離保證了提取的mtDNA不受白蟻體內(nèi)寄生蟲DNA的污染, 其結(jié)果更加真實(shí)可靠; PCR鑒定是通過(guò)特異引物對(duì)16 S rRNA gene的擴(kuò)增, 本研究提取的mtDNA能擴(kuò)增出16 S rRNA gene, 表明了提取的結(jié)果是正確的; 粗提后的純化保證了mtDNA純度, 蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)污染很少, 能滿足RLFP的要求.

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Improvement and Check on the mtDNA extract techniques for termites

JIANG Li-hong1, ZOU Xiang-wu1, NING Di-fei1, XI Zai-xing2

(1. Termite Control Institue of Changde, Changde 415000, China; 2. College of Life Sciences, Hunan University of Arts and Science, Changde 415000, China)

Species identification with mtDNA polymorphisms is an usual method in molecular biology. To identify the species and to explore the evolution of the termites from the DNA level, it is necessary to extract the mtDNA with enough quantity and good quality. In this study, mitochondria of termites is firstly isolated, then CTAB and SDS methods were employed for the extraction of mtDNA, respectively. Purity and concentration of mtDNA were determined by UV spectrophotometer. PCR amplification of mtDNA was executed by specific primers. Results shows that both CTAB the SDS methods can successfully extracted termite mtDNA, but SDS method shows better performance than CTAB method.

termites; mtDNA extract; CTAB; SDS

10.3969/j.issn.1672-6146.2013.01.007

Q 969.29+6

1672-6146(2013)01-0028-03

email:120087902@qq.com.

2013-01-03

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(02JJY2055)

(責(zé)任編校:劉剛毅)