“復(fù)瓣玫瑰紅”組織培養(yǎng)快繁體系的建立

劉建民，薛其勤，李美芹，呂金浮，裴華麗，喬 寧

（濰坊科技學(xué)院蔬菜花卉研究所，山東 壽光 262700）

“復(fù)瓣玫瑰紅”組織培養(yǎng)快繁體系的建立

劉建民，薛其勤，李美芹*，呂金浮，裴華麗，喬 寧

（濰坊科技學(xué)院蔬菜花卉研究所，山東 壽光 262700）

以“復(fù)瓣玫瑰紅”莖段為外植體，進(jìn)行腋芽取材時(shí)期、腋芽節(jié)徑、培養(yǎng)基中無機(jī)鹽離子濃度、不同激素配比和組培苗馴化移栽試驗(yàn)。結(jié)果表明：“復(fù)瓣玫瑰紅”薔薇取材的最佳時(shí)期是5月和11月，所取材料是當(dāng)年生枝條的中間部分，采用1/2MS為基本培養(yǎng)基并添加0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L6-BA的激素組合腋芽萌發(fā)效果最好，其萌發(fā)率最高可達(dá)100%；腋芽分化的最佳培養(yǎng)基為：1/2MS+0.2 mg/LNAA+2.0 mg/L6-BA，增殖系數(shù)達(dá)到8.3；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA組合，生根率可達(dá)97.1%；組培苗移栽時(shí)，以純蛭石為基質(zhì)，先將生根瓶苗移至煉苗室進(jìn)行9 ~ 13 d的移栽前鍛煉，并保持霧狀噴水，移栽成活率可達(dá)80.0%。

“復(fù)瓣玫瑰紅”薔薇；組織培養(yǎng)；快速繁殖

薔薇屬薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa）植物，是世界著名的觀賞植物之一，其花色鮮艷、芳香濃郁，在我國園林綠化中應(yīng)用普遍[1~2]?！皬?fù)瓣玫瑰紅”薔薇是濰坊科技學(xué)院蔬菜花卉研究所選育的新品種。該品種的適應(yīng)性、抗病性強(qiáng)，花型大、花期長、顏色鮮艷，具有較高的觀賞價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值及應(yīng)用前景。

薔薇通常采用嫁接、扦插、組培等方法進(jìn)行繁殖。采用嫁接和扦插進(jìn)行該品種快繁，其繁殖系數(shù)較低，而采用組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖，既可以得到整齊一致的無性系繁殖材料，又能提高繁殖系數(shù)，而且不受繁殖材料的限制，可在短期內(nèi)獲得大量苗木。目前國內(nèi)外已有不少關(guān)于薔薇屬植物的組培報(bào)道[3~5]，但有關(guān)薔薇組培的報(bào)道較少，有關(guān)薔薇組培快繁體系還不完善，存在著誘導(dǎo)率、增殖系數(shù)和生根率低等問題；并且不同品種的薔薇所要求的組培條件差異較大[6~8]。因此有必要開展”復(fù)瓣玫瑰紅”薔薇組培快繁體系的研究，建立成熟的繁殖體系，為新品種的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

本研究對(duì)影響“復(fù)瓣玫瑰紅”薔薇組織培養(yǎng)快繁的因素進(jìn)行探討，主要從腋芽的取材時(shí)期、腋芽節(jié)位、培養(yǎng)基中無機(jī)鹽離子濃度和激素配比等對(duì)”復(fù)瓣玫瑰紅”薔薇組培快繁的影響，建立一套“復(fù)瓣玫瑰紅”薔薇高效離體快繁技術(shù)體系。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

取濰坊科技學(xué)院試驗(yàn)田內(nèi)培養(yǎng)的當(dāng)年生”復(fù)瓣玫瑰紅”薔薇莖段，分別取上、中、下部腋芽為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的消毒與初代培養(yǎng) 取當(dāng)年生枝條，剪去葉片，用吐溫-20和清水沖洗3 ~ 5次，分上（完全未木質(zhì)化）、中（半木質(zhì)化）、下（完全木質(zhì)化）3種腋芽，剪成含有一個(gè)腋芽的莖段，做好標(biāo)記，分別處理：先后浸于75%的酒精中10 s、0.1%HgCl2溶液中20 min，進(jìn)行表面消毒，再用無菌水漂洗4次。用無菌濾紙吸干外植體多余的液體，用已消毒處理過的手術(shù)刀切去每個(gè)帶芽莖段的兩端，腋芽朝上豎插，接種于初代培養(yǎng)基上，每日13 h，在25℃、光照3 000 lx下培養(yǎng)，促使腋芽萌發(fā)。

1.2.2 不同取材時(shí)期對(duì)薔薇腋芽萌芽的影響 2011年5-11月，分別于5、7、9、11月的上旬，于晴朗的上午采薔薇植株當(dāng)年生新梢。接種于1/2MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種外植體數(shù)目為30個(gè)，重復(fù)2次。20 d后統(tǒng)計(jì)腋芽萌發(fā)率，其計(jì)算公式如下：

腋芽萌發(fā)率% =（腋芽萌發(fā)的帶芽莖段數(shù)/接種的帶芽莖數(shù)）×100%

1.2.3 無機(jī)鹽離子濃度對(duì)腋芽萌發(fā)的影響 于2011年9月上旬，取“復(fù)瓣玫瑰紅”薔薇當(dāng)年抽出的新枝條，從枝條頂端開始分成上、中、下3種腋芽，剪成帶有一個(gè)腋芽的莖段，接種于添加0.1mg/L NAA和l.0mg/L6-BA的MS、1/2MS、1/4MS培養(yǎng)基上，每種材料接種數(shù)目30個(gè)，重復(fù)2次，20 d后統(tǒng)計(jì)腋芽萌發(fā)率。

1.2.4 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素組成對(duì)薔薇腋芽萌發(fā)和叢生芽誘導(dǎo)的影響 將消毒處理的莖段接種于含有 NAA和6-BA組合的1/2MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。每處理接種30株外植體，重復(fù)2次。20 d后統(tǒng)計(jì)腋芽萌發(fā)率。

初代培養(yǎng)分化的不定芽和直接分化的試管苗長到2 ~ 3 cm時(shí)，將其縱切分成單株，之后每株再分成單芽接種于添加NAA和6-BA組合或者添加NAA和IBA組合的增殖培養(yǎng)基上（見表1）。每瓶接種6個(gè)，每個(gè)處理每次接種5瓶（30個(gè)芽），重復(fù)2次。培養(yǎng)30d后，統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理的新生芽數(shù)，增殖系數(shù)計(jì)算公式如下：

增殖系數(shù) = 新生芽數(shù)/原來接種芽數(shù)

1.2.5 無菌苗的壯苗與生根培養(yǎng) 當(dāng)再生小苗長到3 ~ 4 cm時(shí)，切取單株幼苗，接種于添加0.1 ~ 0.7 mg/L NAA、0.5 ~ 4 mg/LIBA和0.1 ~ 0.4 mg/L6-BA的1/2MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，長成完整植株。每個(gè)處理接種20株幼苗，重復(fù)2次，30 d后統(tǒng)計(jì)生根率和根系生長情況。

生根率 =（已生根的苗數(shù)/接種的組培苗數(shù)）×100%

1.2.6 馴化與移栽 待試管苗在生根培養(yǎng)基內(nèi)長出5 ~ 6條、長1 ~ 3 cm的粗壯根時(shí)，進(jìn)行試管苗的馴化移栽。移栽前先將生根瓶苗移至煉苗室9 ~ 13 d，進(jìn)行移栽前的鍛煉，使其適應(yīng)外界的光照、溫度。移栽試驗(yàn)在溫室中進(jìn)行，選用3種基質(zhì)，分別為蛭石、珍珠巖、蛭石+珍珠巖（1：1）。將小苗從瓶?jī)?nèi)取出，洗凈附著在根上的培養(yǎng)基，栽植于3種基質(zhì)中。移入基質(zhì)后，保持霧狀噴水，使環(huán)境相對(duì)濕度保持在90 %以上，無需設(shè)置保溫保濕的小環(huán)境，一周后噴施營養(yǎng)液。60 d后可移栽至大田，統(tǒng)計(jì)成活率。

成活率 =（已成活的苗數(shù)/移栽的總苗數(shù)）×100%

表1 增殖培養(yǎng)基的類型Table 1 Types of medium for multiplication mg/L

2 結(jié)果與分析

2.1 初代培養(yǎng)

2.1.1 不同取材時(shí)期對(duì)腋芽萌發(fā)的影響 由圖1可見，接種材料的采集時(shí)期較為顯著地影響腋芽的萌發(fā)，以5月和11月采集的枝條萌發(fā)效果較好，萌芽率分別達(dá)到90.32%和98.21%；7月最低，其萌芽率為68.49%。原因是5月初田間薔薇剛剛萌動(dòng)，體內(nèi)養(yǎng)分充足，激素水平適宜于芽的萌發(fā)；11月薔薇體內(nèi)充分積累養(yǎng)分，腋芽非常飽滿。所以，11月是取材的最好時(shí)期，并且在11月取的材料培養(yǎng)5 d后就開始萌發(fā)，萌發(fā)所需時(shí)間最短，且生長旺盛。在此試驗(yàn)中，整體發(fā)芽率普遍較高，可能是因?yàn)檫x用的培養(yǎng)基較適于萌發(fā)的原因。

2.1.2 無機(jī)鹽離子濃度對(duì)腋芽萌發(fā)的影響 由圖2可以看出，無機(jī)鹽濃度顯著影響腋芽的萌發(fā)，基本培養(yǎng)基為1/2MS時(shí)，3種腋芽的萌發(fā)率都是最高。接種材料的腋芽部位對(duì)其萌發(fā)效果影響顯著，以枝條的中間位置，也就是半木質(zhì)化枝條的腋芽萌發(fā)效果最好，在1/2MS培養(yǎng)基上萌芽率為89.9%；而木質(zhì)化部分最低，在1/2MS培養(yǎng)基上萌芽率為 67.3%。半木質(zhì)化枝條的腋芽萌發(fā)率高，是由于半木質(zhì)化枝條上腋芽的分生能力強(qiáng)、內(nèi)源激素水平利于芽萌發(fā)。

圖1 不同取材時(shí)間對(duì)腋芽萌發(fā)的影響Figure 1 Effect of sampling time on germination of bud

圖2 不同無機(jī)鹽離子濃度對(duì)腋芽萌發(fā)的影響Figure 2 Effect of different medium on germination of bud

2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素組成對(duì)腋芽萌發(fā)和叢生芽誘導(dǎo)的影響

2.2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素組成對(duì)薔薇腋芽萌發(fā)的影響 由表2可以看出，激素及其配比顯著影響腋芽萌發(fā)，NAA濃度為0.1mg/L時(shí)，腋芽萌發(fā)率較好，其中以l/2MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA的組合最好；而l/2MS+ 0.1 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA和l/2MS+0.1 mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA的組合，其腋芽萌發(fā)率也較高，但萌發(fā)出的小苗玻璃化現(xiàn)象較為嚴(yán)重，尤其是l/2MS+0.1 mg/L NAA+3.0mg/L 6-BA組合。NAA濃度為0.2 mg/L時(shí)，腋芽萌發(fā)率達(dá)88%左右，其萌發(fā)率不及NAA濃度為0.1 mg/L的組合，并且也有部分小苗出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。

2.2.2 不同激素配比對(duì)薔薇叢生芽誘導(dǎo)的影響 由圖3可以看出，在NAA和6-BA組合中，l/2MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA的組合，其腋芽增殖效果最好，增殖系數(shù)達(dá)到8.3，生長旺盛；其次是l/2MS+0.3 mg/L NAA +1.0mg/L 6-BA的組合，其增殖系數(shù)為7.8。NAA在0.1 mg/L的水平上，6-BA的濃度為3 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)最高；并且隨著6-BA濃度的增加，其增殖系數(shù)有升高的趨勢(shì)，但再生苗的玻璃化現(xiàn)象加重。NAA在0.2 mg/L的水平上，隨6-BA濃度的升高，增殖系數(shù)呈先增后減的趨勢(shì)，6-BA的濃度在2 mg/L的水平上增殖系數(shù)最高，并且再生苗的葉色墨綠、生長正常。NAA在0.3 mg/L的水平上，6-BA的濃度在1 mg/L的水平上增殖系數(shù)最高，隨著6-BA濃度的升高，增殖系數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。6-BA在1 mg/L的水平上，隨NAA濃度的增加，其增殖系數(shù)有升高的趨勢(shì)；6-BA在1.5 ~ 2.5mg/L的水平上，隨NAA濃度的增加，增殖系數(shù)呈先增后減的趨勢(shì)，其中以1.5 mg/L最為顯著；6-BA的濃度在3 mg/L的水平上，隨NAA濃度的增加，增殖系數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖3 不同激素組合對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響Figure 3 Effect of different hormones ratio on induction of clump shoot

在IAA和6-BA的組合中，l/2MS+0.1 mg/L IAA+1.0 mg/L 6-BA的組合最好，其增殖系數(shù)為2.9。在IAA為0.1 mg/L的水平上，隨著6-BA濃度的升高，增殖系數(shù)呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。IAA在0.2和0.3 mg/L的水平上，隨6-BA濃度的升高，增殖系數(shù)呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)，但總體增生系數(shù)都較低。6-BA在0.5 ~ 1.5 mg/L的水平上，隨IAA濃度的增加，增殖系數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)；6-BA的濃度在2.0 mg/L的水平上，隨IAA濃度的增加，增殖系數(shù)呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。

總之，本試驗(yàn)組合中，NAA和6-BA組合增殖效果優(yōu)于IAA和6-BA組合。

2.3 壯苗生根培養(yǎng)

2.3.1 激素配比對(duì)壯苗生根培養(yǎng)的影響 從表3中可以看出，當(dāng)只添加NAA時(shí)，隨著NAA濃度的增大，生根率有降低的趨勢(shì)，愈傷組織的呈加重趨勢(shì)。在NAA和6-BA的組合中，NAA在0.1 mg/L的水平上時(shí)，整體生根率最高，其中1/2MS+0.1 mg/L NAA+ 0.2 mg/L 6-BA組合生根率最高；NAA在0.3 ~ 0.7 mg/L的水平上時(shí)，隨6-BA濃度的增大，生根率有上升的趨勢(shì)，但總體上還是隨NAA濃度的增加，生根率下降。在NAA和IBA的組合中，NAA在0.1 mg/L的水平上時(shí)，整體生根率水平最低，并隨IBA濃度的升高，生根率有降低的趨勢(shì)；NAA在0.3 mg/L的水平時(shí)，整體生根率最高，其中1/2MS+0.3 mg/L NAA+2 mg/L IBA組合生根率最高；NAA在0.5 ~ 0.7 mg/L的水平時(shí)，隨IBA濃度的增大，生根率有上升的趨勢(shì)，但總體上還是隨NAA濃度的增加，生根率下降。

表3 不同激素及其配比對(duì)不定根形成的影響Table 3 Effect of different hormones and ratio on rooting rate

2.4 組培苗的馴化與移栽

在生根培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)20 d即可形成較健壯的根，平均每株可生根8 ~ 12條，根長1 ~ 3 cm，株高4.0 ~ 7.0 cm，此時(shí)可準(zhǔn)備移栽。移栽前先將生根瓶苗移至煉苗室9 ~ 13 d，進(jìn)行移栽前的鍛煉。

在移栽試驗(yàn)中，以純蛭石為基質(zhì)移栽成活率最高，為80%以上；蛭石：珍珠巖（1：1）成活率為72%；以珍珠巖為基質(zhì)，移栽成活率低于前二者。從珍珠巖與蛭石的物理性能看，蛭石吸水性及保水性均優(yōu)于珍珠巖；色深，吸熱性能好；質(zhì)地比珍珠巖致密，散熱慢，基質(zhì)溫度、尤其是夜間溫度高，有利于新根的形成。

試管生根苗，移入基質(zhì)后，保持霧狀噴水，相對(duì)濕度保持在90%以上，一周后噴施營養(yǎng)液。本移栽試驗(yàn)證明，其移栽成活率可達(dá)80%以上，60 d后可移栽至大田。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，“復(fù)瓣玫瑰紅”薔薇的組織培養(yǎng)快速繁殖體系的建立受多種因素的限制，外植體的取材時(shí)期和部位、培養(yǎng)基的無機(jī)鹽離子濃度、激素組成對(duì)其組織培養(yǎng)快繁體系的建立具有顯著影響。

“復(fù)瓣玫瑰紅”薔薇取材的最佳時(shí)期是5月和11月，所取材料是當(dāng)年生枝條的中間部分，采用1/2MS為基本培養(yǎng)基并添加0.1mg/L NAA+1.0 mg/L6-BA的激素組合腋芽萌發(fā)效果最好，其萌發(fā)率最高可達(dá)100%，腋芽分化的最佳培養(yǎng)基為：1/2MS+0.2 mg/LNAA+2.0 mg/L6-BA，增殖系數(shù)達(dá)到8.3。生根試驗(yàn)表明，采用1/2MS為基本培養(yǎng)基并添加0.1mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA組合生根率最高，可達(dá)97.1%。組培苗移栽時(shí)，以純蛭石為基質(zhì)，先將生根瓶苗移至煉苗室進(jìn)行9 ~ 13 d的移栽前鍛煉，并保持霧狀噴水，移栽成活率可達(dá)80.0%。

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Establishment of Rapid in-vitro Propagation System for Rosa multiflora var. ‘multipetal Rose-red ’

LIU Jian-min，XUE Qi-qin，LI Mei-qin*，LU Jin-fu，PEI Hua-li，QIAO Ning
（Weifang University of Science and Technology, Shouguang 262700, China）

Experiments were conducted on effect of sampling time, explants types, different cultures and different hormones ratio on rapid in-vitro propagation of Rosa multiflora var. ‘multiprtai Rose-red’ using the stem segment as the explant. The results showed that the best sampling time was in May and November, the best stem segment was the semi-lignified branches in the middle of the shoots. The germination rate of bud topped to 100% when the medium was 1/2MS supplemented with 0.1mg/L NAA and l.0mg/L 6-BA. The optimal medium for multiplication of adventitious buds was 1/2MS supplemented with 0.2mg/L NAA and 2.0mg/L 6-BA, and the multiplication coefficient was up to 8.3. The best medium for rooting was 1/2MS supplemented with 0.1mg/L NAA and 0.2mg/L 6-BA, and the rooting rate was up to 97.1%. The conservation rate after transplanting reached up to 80.0% using the pure vermiculite as substrate after 9-13 days acclimatization, and keeping mist spray.

Rosa multiflora var. ‘multiprtai Rose-red’; rapid propagation; tissue culture in vitro

S723.1+32.6

B

1001-3776（2013）05-0057-05

2013-04-29；

2013-06-19

山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目（J10LC78）

劉建民（1968-），男，山東壽光人，副教授，從事植物生物技術(shù)研究；*通訊作者。