人參果莖尖分生組織試管苗再生體系的建立與優(yōu)化

張菲菲，張金文，石 菁

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院國家級植物生產(chǎn)類實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，甘肅 蘭州 730070）

人參果（Solanum lycopersicum），又名茄瓜、香瓜茄、南美仙桃等，為茄科茄屬多年生草本植物，是20世紀(jì)80年代后國內(nèi)引進(jìn)和推廣種植的新型果蔬作物，果肉清香多汁、高蛋白、低糖、低脂肪且富含多種微量元素，特別是硒和鉬的含量較高，也是糖尿病人的理想水果［1，2］。近年來，國內(nèi)在節(jié)能日光溫室栽培人參果的面積迅速擴(kuò)大，部分地區(qū)已成規(guī)?；N植［3］。甘肅省人參果栽培主要分布在武威市涼州區(qū)、天?？h、古浪縣，其中，涼州區(qū)的張義鎮(zhèn)和天祝縣的哈溪鎮(zhèn)栽培相對集中，面積較大，已發(fā)展成為河西走廊的重要產(chǎn)業(yè)［4］。

伴隨著產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的逐年推進(jìn)，人參果的栽培也陸續(xù)出現(xiàn)了一些問題。人參果在北方及西部多采用溫室栽培，農(nóng)戶為降低生產(chǎn)成本，自主、無序的扦插繁殖，且無限期的延長栽培年限，導(dǎo)致品種混雜、種性嚴(yán)重退化，病毒病為害加重，品質(zhì)、產(chǎn)量下降。有研究證明病毒是通過維管束傳導(dǎo)的，利用維管束尚未分化的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，再生植株結(jié)合高溫脫毒處理后可以獲得健康苗［5］。有關(guān)人參果脫毒及快繁研究已有報道［5－8］，但系統(tǒng)的將莖尖脫毒和植株再生體系相結(jié)合的報道較少。借鑒前人的技術(shù)，經(jīng)過研究優(yōu)化，建成了實(shí)用性良好的人參果脫毒及再生體系，為人參果脫毒種苗生產(chǎn)及下一步通過基因工程技術(shù)獲得抗病毒品系及優(yōu)良種質(zhì)資源奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人參果組織培養(yǎng)材料由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院遺傳育種實(shí)驗(yàn)室提供，外植體材料采自甘肅省武威市涼州區(qū)張義鎮(zhèn)堡子村，冰盒保存帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 無菌外植體的建立 接種之前對材料進(jìn)行徹底的消毒處理。自來水沖洗2h，置于超凈工作臺，剪成1cm的單芽莖段，75%乙醇浸泡20s，無菌水洗2遍，濾紙吸干水分；浸于0.1%升汞7min，無菌水洗6次；將進(jìn)行表面滅菌消毒后的材料接種在 MS＋30 g/L蔗糖的培養(yǎng)基上，及時去除或轉(zhuǎn)接污染材料。

1.2.2 莖尖剝離、接種及培養(yǎng) 研究初期借鑒了陸瑞菊等［5］的研究方法。，預(yù)先在35℃的培養(yǎng)箱對瓶苗熱處理1個月。在無菌條件下，剪取0.5～0.7cm長的莖尖，接種到MS培養(yǎng)基上。待莖尖成活后，再在解剖鏡下剝?nèi)?.2mm的莖尖接種到添加1.0mg/L的6－BA和0.05mg/L NAA的啟動培養(yǎng)基上。25℃，光強(qiáng)3 000lx、每天光照16h/d、黑暗8h/d的光周期下培養(yǎng)。連續(xù)5代重復(fù)此高溫加剝莖尖培養(yǎng)法以期獲得人參果脫毒苗。

1.2.3 病毒檢測及植株快繁復(fù)壯 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（DAS－ELISA），對第5代高溫脫毒試管苗進(jìn)行檢測，所涉及CMV，TMV及PVM病毒包被抗體和酶標(biāo)抗體均購自英國安德珍（ADGEN）生物技術(shù)有限公司。根據(jù)測定的吸光度，求出被測樣品光密度值（P）與標(biāo)樣（健康材料）光密度值（N）比值（P/N）。結(jié)果判定：P/N＜1.5者，為陰性（幾乎不帶毒）；P/N介于1.50～1.99者，為輕度帶毒材料；P/N≥2.0者，則為帶毒材料。將檢測合格的試管苗接種在1/2MS培養(yǎng)基＋0.5mg/L NAA培養(yǎng)基上擴(kuò)繁復(fù)壯。

1.2.4 再生體系建立與優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計 以MS為基本培養(yǎng)基，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用L9（34）正交設(shè)計，共9個處理，每處理重復(fù)3次，每個重復(fù)為4盤，每盤接入5個脫毒苗莖段或葉緣剪傷葉盤。各因子及水平見表1，觀察記錄愈傷誘導(dǎo)結(jié)果，使用DPS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

分化培養(yǎng)基采用正交設(shè)計L9（34），共9個處理，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)為4個培養(yǎng)至0.5～1.0cm2大小的莖段或葉盤愈傷，各因子及水平見表2，觀測統(tǒng)計各處理誘導(dǎo)分化叢生芽的結(jié)果，使用DPS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

生根培養(yǎng)基采用完全隨機(jī)設(shè)計，以1/2MS（大量元素減半）為基本培養(yǎng)基，在4種不同配比的生根培養(yǎng)基 （H 15g/L 蔗糖；I 15g/L 蔗糖 ＋0.5mg/L NAA；J 15g/L蔗糖＋1.0mg/L NAA；K 30g/L 蔗糖）上各轉(zhuǎn)接40個分化得來的單芽莖段，觀察統(tǒng)計各處理生根情況。

表1 愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基因素與水平Table 1 Treatments and level design of callus mediums

表2 分化培養(yǎng)基因素與水平Table 2 Treatment and level design of differentiation mediums

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫莖尖脫毒結(jié)果

鑒于大田中人參果采用扦插的方式繁殖，植株產(chǎn)生不定芽和不定根的能力很強(qiáng)，因此，在外植體初代培養(yǎng)時選用基本MS培養(yǎng)基，單芽莖段單瓶接種120瓶（表3），成活97株，污染率達(dá)19.1%，在今后的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)考慮適當(dāng)延長升汞處理時間。

實(shí)驗(yàn)室原組培苗及外植體材料共120瓶，高溫莖尖脫毒結(jié)果見表3。剝?nèi)?.5～0.7cm大小的莖尖，接種7d后，繼續(xù)剝?nèi)?.2mm莖尖，成活的莖尖在一周后逐漸變綠，基部逐漸增大，形成少量愈傷樣組織，1個月可見明顯伸長的小莖，2個月可成苗。研究發(fā)現(xiàn)，隨著莖尖剝離代數(shù)的增加，多次經(jīng)過高溫逆境的鍛煉，莖尖成活率有所上升，可接近75%。另外，適當(dāng)?shù)拈g斷變溫處理更有利于莖尖成活和病毒脫除。

表3 接種情況Table 3 Inoculate situation

2.2 病毒檢測結(jié)果

對隨機(jī)取樣的10份第5代試管苗的ELISA病毒檢測（表4），結(jié)果顯示只有1份材料輕微帶毒（P2），其余均為陰性，充分說明高溫脫毒方法可行性極高。實(shí)驗(yàn)對檢測合格的9份材料進(jìn)行了擴(kuò)繁復(fù)壯，為后續(xù)再生體系建立做好了準(zhǔn)備。

2.3 再生體系建立

2.3.1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選 分別以脫毒苗莖段和葉盤為材料，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計對6－BA，ZT和2，4－D濃度配比進(jìn)行了篩選，愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果見表5。研究發(fā)現(xiàn)，人參果再生能力很強(qiáng)，無論葉片還是莖段均能成功誘導(dǎo)出Ⅱ型愈傷組織，誘導(dǎo)結(jié)果顯示，L6（A2B3C1：1mg/L 6－BA＋1.6 mg/L ZT＋0.2mg/L 2，4－D）為最佳培養(yǎng)基激素組合，適宜濃度的2，4－D的誘導(dǎo)效應(yīng)要強(qiáng)于6－BA及ZT。對葉盤誘導(dǎo)25～35d，即可見圍繞受傷葉緣產(chǎn)生黃白色顆粒狀愈傷，愈傷生成基數(shù)大，但后期生長較緩慢（圖1－A）；對莖段誘導(dǎo)20～30d，即可見先兩端后中間產(chǎn)生黃白色團(tuán)狀愈傷，后期體積增大快、生長旺盛（圖1－B），但Ⅰ、Ⅱ型愈傷組織混合生長（圖1－C），若及時轉(zhuǎn)接至L6培養(yǎng)基上，Ⅰ型愈傷會向Ⅱ型轉(zhuǎn)化。莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷所需時間短，愈傷質(zhì)量好，且愈傷誘導(dǎo)率總體高于葉盤，但受傷葉片沿葉緣形成的愈傷點(diǎn)多，雖然較分散，生長較慢，只要在誘導(dǎo)40d后，繼代轉(zhuǎn)接至L6培養(yǎng)基，進(jìn)行暗培養(yǎng)，愈傷生長速度也會明顯加快。

表4 人參果病毒抽樣檢測結(jié)果Table 4 Sampling detection of pepino virus

圖1 愈傷誘導(dǎo)情況Fig 1 The situation of callus induction

表5 不同培養(yǎng)基愈傷誘導(dǎo)結(jié)果Table 5 The result of callus induction for different mediums

2.3.2 分化培養(yǎng)基的篩選 將培養(yǎng)至0.5～1.0cm2大小的愈傷組織轉(zhuǎn)入不同6－BA、IAA、GA3和ZT濃度配比的分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)，進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)，45d統(tǒng)計平均成芽數(shù)及誘導(dǎo)率，DPS處理分析結(jié)果見表6。

實(shí)驗(yàn)篩選出最佳的分化培養(yǎng)基激素配比方案為F4（D2E1F2G3：2mg/L 6－BA＋0.1mg/L IAA＋1 mg/L GA3＋2mg/L ZT），愈傷分化率均達(dá)100%，且單塊愈傷最高平均分化可達(dá)13.42個不定芽?？傮w來看，適宜的6－BA濃度對分化的影響最為顯著，生長素與分裂素的比例也至關(guān)重要，各個處理間差異性較為顯著。葉盤誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)綠快，叢生芽點(diǎn)多，成芽所需天數(shù)少，分化率明顯高于莖段，但前期不定芽生長較緩，芽弱，可作為轉(zhuǎn)基因研究中遺傳轉(zhuǎn)化部分的良好材料（圖2－D）；莖段誘導(dǎo)出的愈傷部分轉(zhuǎn)綠，叢生芽分化率相對較低，出芽部位多在愈傷頂端，但不定芽長勢較壯（圖2－E），且部分可自行長出根系，可作為離體快繁的良好材料（圖2－F）。

圖2 愈傷分化情況Fig.2 The situation of callus differentiated

表6 不同培養(yǎng)基愈傷組織分化結(jié)果Table 6 The result of Calli differentiated for different mediums

2.3.3 生根培養(yǎng)基的優(yōu)化 生產(chǎn)中，人參果植株扦插即可成活，組培苗在MS培養(yǎng)基中即可生根，但所需時間較長，生長速度較慢。實(shí)驗(yàn)對生根條件進(jìn)行了優(yōu)化（表7），將叢生不定芽轉(zhuǎn)接在I組，即1/2MS＋15g/L蔗糖＋0.5mg/L NAA培養(yǎng)基中，只需3～4d即可生根，后期根系發(fā)達(dá)，且有助于葉腋處側(cè)枝生長，可大大節(jié)約組培快繁時間，且明顯提高出瓶移栽成活率。

表7 生根培養(yǎng)基的優(yōu)化結(jié)果Table 7 The optimizing of rooting mediums

3 討論

人參果外植體接種到培養(yǎng)基污染率的高低與取材部位及消毒是否徹底有很大關(guān)系。研究參照陸瑞菊［5］的方法，采用連續(xù)5代35℃高溫?zé)崽幚砑觿兦o尖培養(yǎng)的方法，獲得了人參果脫毒試管苗，對隨機(jī)抽樣的脫毒試管苗采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行病毒檢測，脫毒率達(dá)90%，說明通過莖尖脫毒培養(yǎng)和快速繁殖的確是生產(chǎn)人參果無病毒種苗的有效途徑。

愈傷組織的誘導(dǎo)是非常復(fù)雜的生理、生化過程，每一步都受到生長物質(zhì)的調(diào)控。高濃度的生長素和細(xì)胞分裂素配比有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，而低濃度配比則有利于愈傷組織的分化［9］。對于人參果再生體系建立的研究，翟進(jìn)升［10］認(rèn)為適于莖尖愈傷組織形成和分化的培養(yǎng)基為 MS＋0.2mg/L NAA＋2.0mg/L 6－BA。研究采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計，對于人參果愈傷誘導(dǎo)及分化的激素配比進(jìn)行優(yōu)化研究，篩選出最適人參果愈傷誘導(dǎo)的配方為1mg/L 6－BA＋1.6mg/L ZT＋0.2mg/L 2，4－D，適合分化誘導(dǎo)的配方為2mg/L 6－BA＋0.1 mg/L IAA＋1mg/L GA3＋2mg/L ZT。誘導(dǎo)出的Ⅱ型愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密，增殖速度較快，分化狀況良好。研究還對莖段和受傷葉片的誘導(dǎo)及分化效果做了比較，發(fā)現(xiàn)各有所長。葉盤誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)綠快，叢生芽點(diǎn)多，成芽所需天數(shù)少，前期不定芽生長較緩，芽弱，可作為轉(zhuǎn)基因研究中遺傳轉(zhuǎn)化部分的良好材料；莖段誘導(dǎo)出的愈傷部分見光轉(zhuǎn)綠，叢生芽分化率相對葉盤較低，出芽部位多在愈傷頂端，不定芽生長較壯，且部分可自行長出根系，可作為離體快繁的良好材料。另外，光培養(yǎng)條件下將愈傷組織轉(zhuǎn)入愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基也可見愈傷組織生長變綠并分化出叢生芽，但極緩慢，同樣條件下轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基2mg/L 6－BA＋0.1 mg/L IAA＋1mg/L GA3＋2mg/L ZT上，分化出的叢生芽長勢較快。暗培養(yǎng)條件下將愈傷組織轉(zhuǎn)入愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，增殖較快，但會出現(xiàn)褐化問題。若能及時轉(zhuǎn)入低濃度培養(yǎng)基0.1mg/L 2，4－D＋1 mg/L 6－BA，即可有效減輕褐化問題。暗培養(yǎng)增殖的愈傷一經(jīng)見光即可產(chǎn)生綠色芽點(diǎn)，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基后分化出的叢生芽，長勢整齊、旺盛。剪取不定芽接入1/2MS培養(yǎng)基＋15g/L蔗糖＋0.5mg/L NAA的培養(yǎng)基上，生根快，植株長勢健壯，可有效提高移栽成活率。

實(shí)驗(yàn)研究充分發(fā)揮了正交設(shè)計法的優(yōu)勢，建立并優(yōu)化了人參果植株脫毒及再生體系，較大的提高了實(shí)驗(yàn)效率，不僅為人參果脫毒及工廠化育苗提供了依據(jù)，而且為今后轉(zhuǎn)基因研究的遺傳轉(zhuǎn)化工作奠定了良好的基礎(chǔ)。

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