RP-HPLC法測(cè)定金銀花提取物中藁苯內(nèi)酯的含量※

宋曉燕 劉翠紅

RP-HPLC法測(cè)定金銀花提取物中藁苯內(nèi)酯的含量※

宋曉燕 劉翠紅

目的建立反相高效液相色譜法測(cè)定金銀花提取物中藁本內(nèi)酯含量的方法。方法采用伊利特Hypersil ODS2（4.6mm×250mm×5μm）色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-水（60：40），流速0.9ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：326nm。結(jié)果藁苯內(nèi)酯在0.01～0.50mg內(nèi)有良好的線性關(guān)系，平均回收率為99.2%，RSD為0.3%（n=6）。結(jié)論本法操作靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，可作為金銀花提取物的質(zhì)量控制方法。

反相高效液相色譜法；金銀花提取物；藁苯內(nèi)酯；含量測(cè)定

金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花。夏初花開放前采收，干燥，入藥[1]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，金銀花為臨床常用中藥，具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱之功效，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究證明其具有抗菌、抗病毒、解熱、增強(qiáng)免疫力、止血、利尿和降低膽固醇等作用[2]。一般情況，金銀花以綠原酸含量為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，但綠原酸并非金銀花中唯一抑菌成分?，F(xiàn)代研究表明，金銀花中主要含有揮發(fā)油、黃酮類、有機(jī)酸、三萜類及無機(jī)元素。揮發(fā)油又名精油，是金銀花中的另一類主要有效成分，而含量較高的藁苯內(nèi)酯為揮發(fā)油主要活性成分之一，具有解痙擴(kuò)血管等作用[3-5]。本文采用RP-HPLC法測(cè)定金銀花提取物中藁苯內(nèi)酯的含量，所測(cè)藁苯內(nèi)酯色譜峰與相鄰色譜峰得到很好的分離，其操作靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，具有普遍的實(shí)用意義。其中金銀花提取物是由超臨界CO2萃取所得。

1 材料

1.1 儀器MLtimate 3000高效液相色譜儀；伊利特Hypersil ODS2色譜柱（4.6mm×250mm×5μm）。

1.2 試藥金銀花提取物（廣州漢方現(xiàn)代中藥研究開發(fā)有限公司，批號(hào)20100301）。藁苯內(nèi)酯對(duì)照品（原中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100102-9907）。甲醇：AR級(jí)，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心。水：重蒸餾水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

2.1.1 色譜條件色譜柱：伊利特Hypersil ODS2（4.6mm×250mm×5μm）；色譜柱溫度：30℃；流動(dòng)相：甲醇-水（60：40）；流速：0.9ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：326nm。理論塔板數(shù)按藁苯內(nèi)酯計(jì)算不低于3000。

2.1.2 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)分別精密吸取藁苯內(nèi)酯對(duì)照品溶液，供試品溶液各10μL注入高效液相色譜儀測(cè)定，色譜圖見圖1。藁苯內(nèi)酯的保留時(shí)間約為37.5min，與其它組分分離良好（分離度大于1.5），無干擾。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 對(duì)照貯備液的制備精密稱取藁苯內(nèi)酯對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備取本品約0.10g，精密稱定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解，超聲10min，過濾，精密取過濾液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過0.45μm濾膜，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察分別精密吸取對(duì)照貯備液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml置10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm濾膜過濾，得對(duì)照溶液。分別吸取10μL各對(duì)照溶液，進(jìn)行HPLC分析，以峰面積（A）-濃度（C）回歸，結(jié)果見表1。

表1 藁苯內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

回歸方程為Y=92.142 X-0.0286，相關(guān)系數(shù)R=0.9992。以上結(jié)果表明藁苯內(nèi)酯在0.01～0.50mg范圍內(nèi)，與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照貯備液2ml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。每次進(jìn)樣10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積分別為：

27.619 ，27.348，27.157，27.518，27.892，27.813，得平均峰面積值為27.558，計(jì)算其精密度RSD=1.0%，可見其精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，分別在0、1、2、4、6、8h進(jìn)樣10μL測(cè)定，以峰面積計(jì)算得藁苯內(nèi)酯的峰面積RSD分別為1.1%（n=6），表明供試品溶液中藁苯內(nèi)酯在8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)取同批供試品（20100301）6份，精密稱定，按2.3項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣10μL測(cè)定，測(cè)得藁苯內(nèi)酯33.5%，RSD為0.6%（n=6），表明本法具有良好的重復(fù)性。

2.4.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)采用加樣回收法，精密稱取已測(cè)定含量的金銀花提取物樣品（20100301）6份，每份0.10g，分別置25ml容量瓶中，各加入1ml對(duì)照貯備液，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。進(jìn)樣10μL，測(cè)定其峰面積，按測(cè)得量與加入量計(jì)算回收率分別為99.18，99.58，98.87，99.47，99.05，98.94。測(cè)得平均回收率為99.2%，RSD=0.3%(n=6)。

2.5 樣品測(cè)定取3批樣品（20100301、20100302、20100303），按2.3項(xiàng)下方法制備，分別精密吸取10μL注入液相色譜儀，測(cè)定樣品中藁苯內(nèi)酯的含量，結(jié)果見表2。

表2 金銀花提取物中藁苯內(nèi)酯的含量(%)

3 結(jié)論與討論

一般認(rèn)為，金銀花的有效成分為綠原酸類化合物，并以綠原酸含量作為金銀花的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。本文對(duì)金銀花中另一類的抑菌成分藁苯內(nèi)酯的質(zhì)量研究具有現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)測(cè)定了3批金銀花提取物中藁苯內(nèi)酯的含量，通過計(jì)算，其含量均在30%以上。本文所述方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性及穩(wěn)定性都比較好，可快速測(cè)定金銀花提取物中藁苯內(nèi)酯含量，在實(shí)際生產(chǎn)中可為該提取物質(zhì)量控制提供依據(jù)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(2000年版1部)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2000：177-178.

[2] 王筠默.中藥藥理學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1999：35-38.

[3] 滕紅麗.金銀花藥材的綜合研究分析[J].中藥材,2007,30(6)：744-748.

[4] 阮鳴,彭國(guó)平.金銀花揮發(fā)油的萜類化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2005,16(1)：59-61.

[5] 陶靜儀,阮于平,梅其炳,等.當(dāng)歸成分藁苯內(nèi)酯平喘作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1984,19(8)：561-565.

Content Determination of Ligustilide in Honeysuckle Flower Extract by RP-HPLC

Song Xiaoyan Liu Cuihong

ObjectiveTo develop a method for the content determination of ligustilide in honeysuckle flower extract by RHPLC.MethodsChromatographic column (4.6mm×250mm×5μm) of Erie's Hypersil ODS2 was used. The mobile phase was methanol-water (60∶40), the flow rate was 0.9 ml/min, and the detection wavelength was at 326 nm.ResultsThere was a good linear relationship in the range of 0.01～0.50mg.The average recovery was 99.2%, RSD=1.0%(n=6).ConclusionThe method is sensitive, accurate, simple and can be used for quality control of honeysuckle flower extract.

RP-HPLC; Honeysuckle flower extract; Ligustilide; Content determination

R927.2

A

1673-5846(2013)02-0054-02

廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司，廣東廣州 510240

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目：從化中藥及天然產(chǎn)物關(guān)鍵技術(shù)集成創(chuàng)新平臺(tái)（項(xiàng)目編號(hào)：2010A1-E00011）

宋曉燕，女，大學(xué)本科，藥學(xué)工程師，研究方向：中藥和保健食品。郵箱：xiaoyan_s@126.com。