四川泡菜微生態(tài)分布及其與鹽度、酸度的關(guān)系*

羅松明，劉書亮，杜曉華，陳功，顏正財

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安，625014)2(四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，四川成都，611130)3(四川省吉香居食品有限公司，四川眉山，620039)

泡菜是一種酸咸適度、營養(yǎng)美味的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，其含有多種維生素、礦質(zhì)元素以及豐富的膳食纖維，已成為世界公認(rèn)的健康發(fā)酵蔬菜制品［1］。泡菜中的乳酸菌也是一種益生菌，如乳酸菌代謝過程中產(chǎn)生的乳酸菌素的特殊功能近年來引起了科技產(chǎn)業(yè)界的極大關(guān)注［2］，Huang等［3］對從中國泡菜產(chǎn)品中分離出的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus 05－10)產(chǎn)生的片球菌素的特性進行了分析和應(yīng)用研究，發(fā)現(xiàn)這種片球菌素可以應(yīng)用于食品保鮮領(lǐng)域，尤其是肉制品的保鮮方面。

四川泡菜產(chǎn)業(yè)已初具規(guī)模，建成了以眉山、成都、宜賓、南充、內(nèi)江等為代表的泡菜加工專用原料基地，四川泡菜在國內(nèi)市場的占有率達(dá)50%以上，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷美國、歐盟、加拿大、澳大利亞、東南亞等20多個國家和地區(qū)［4］。但是，在四川傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜企業(yè)中，目前僅有少數(shù)企業(yè)具備工業(yè)化生產(chǎn)能力，其余大多屬于作坊式生產(chǎn)模式;還有很多企業(yè)采用非發(fā)酵型拌制工藝;而且泡菜生產(chǎn)的工藝傳統(tǒng)，設(shè)備落后，衛(wèi)生條件較差，半成品、產(chǎn)品極易出現(xiàn)產(chǎn)膜、生花、軟化變質(zhì)現(xiàn)象，使其質(zhì)量不穩(wěn)定、安全性差等問題［5］。

泡菜的質(zhì)量主要基于其滋味、香氣、色澤、形態(tài)、組織狀態(tài)(或稱質(zhì)構(gòu)特性)及理化指標(biāo)要求(如pH、酸度和鹽度)等來進行評價［6］，而泡菜的這些質(zhì)量指標(biāo)又取決于泡菜的生產(chǎn)工藝，尤其是泡菜發(fā)酵過程中的微生物的作用。蘇揚［7］和王曉飛［8］分別對泡菜的風(fēng)味品質(zhì)與微生物發(fā)酵的關(guān)系進行了研究，結(jié)果表明泡菜良好風(fēng)味的形成與乳酸菌發(fā)酵、乙醇發(fā)酵和醋酸發(fā)酵等有關(guān)。但是傳統(tǒng)四川泡菜的生產(chǎn)大多為蔬菜自然發(fā)酵，其十分復(fù)雜的微生物發(fā)酵過程受地域、季節(jié)、發(fā)酵溫度、時間、鹽分、原輔料等多種因子的影響［9］，泡菜產(chǎn)品的安全性的影響因子也是如此，如Khuanwalai Maklon［10］從日本的一種市售即食型泡菜Asazuke樣品中的單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)進行了分離和鑒定，而這種泡菜中的李斯特菌主要來源于某種眾所周知的受到李斯特菌污染的蔬菜原料。

近年來，眾多的研究者們對泡菜發(fā)酵中的乳酸菌區(qū)系分布、菌種篩選進行了廣泛研究，張鵬［11］和鄯晉曉［12］對傳統(tǒng)四川泡菜在發(fā)酵過程中的酵母菌進行了分離鑒定，并篩選出了作為泡菜發(fā)酵劑的酵母菌株，這說明泡菜中的微生物具有多樣性。本實驗采集了成都、眉山兩個地區(qū)不同市場點的傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜水和兩個泡菜生產(chǎn)企業(yè)的不同鹽漬池的鹽漬水，對所有樣品的pH、酸度、鹽度及其微生態(tài)進行了測定與分析。

1 材料和方法

1.1 材料

2010年4月于眉山及成都市場不同點采集不同原料傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜水13份，于四川泡菜企業(yè)A、四川泡菜企業(yè)B采集不同原料不同鹽漬池的鹽漬水16份。隨機取樣約100 mL于無菌離心管中，對樣品進行編號，填寫采樣記錄表，貼明標(biāo)簽，裝入冰盒，迅速帶回實驗室。樣品特點詳見表1。

表1 樣品來源及特點Table 1 Sampling point of the samples and their characteristics

1.2 培養(yǎng)基

作為乳酸菌的計數(shù)測定用的MRS培養(yǎng)基，及作為明串珠菌的計數(shù)測定用的蔗糖硫胺培養(yǎng)基，均參照凌代文［13］的方法制備。

作為乳桿菌計數(shù)測定用的改良MRS培養(yǎng)基，參照張剛［14］的方法制備。

醋酸菌分離計數(shù)培養(yǎng)基，參照張永鳳［15］的方法制備。

M17培養(yǎng)基(乳球菌計數(shù)測定)、假單胞CFC選擇性培養(yǎng)基(假單胞菌計數(shù)測定)、孟加拉紅培養(yǎng)基(酵母菌、霉菌計數(shù)測定)及營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(菌落總數(shù)及芽孢桿菌計數(shù)測定)均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

菌株鑒定用各種培養(yǎng)基［12］。

1.3 樣品理化指標(biāo)分析

pH值的測定:按照GB/T 10468－1989《水果和蔬菜產(chǎn)品pH值的測定方法》測定。

酸度的測定:按照GB/T 12456－2008《食品中總酸的測定》中酸堿滴定法測定，結(jié)果以乳酸計。

鹽度的測定:參照GB/T 5009.39－2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》進行，結(jié)果以NaCl計。

1.4 微生物分離培養(yǎng)與計數(shù)

采用平板培養(yǎng)計數(shù)法。無菌吸取10 mL樣品于裝有90 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，制成10－1稀釋液后于試管內(nèi)進行梯度稀釋至適宜稀釋度進行以下各種微生物的分離培養(yǎng)與計數(shù)。

菌落總數(shù)的測定:參照GB 4789.2－2010《食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》進行，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注平板37℃培養(yǎng)48 h計數(shù)。

酵母菌與霉菌的測定:參照GB 4789.15－2010《食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》進行，孟加拉紅培養(yǎng)基傾注平板25℃培養(yǎng)3～5 d計數(shù)。

乳桿菌的測定:傾注改良MRS培養(yǎng)基平板30℃培養(yǎng)48 h計數(shù)。

乳球菌的測定:傾注M17培養(yǎng)基平板30℃培養(yǎng)48 h計數(shù)。

明串珠菌的測定:傾注蔗糖硫胺培養(yǎng)基平板25℃培養(yǎng)48 h計數(shù)。

醋酸菌的測定:涂布醋酸菌分離計數(shù)培養(yǎng)基平板30℃培養(yǎng)48 h計數(shù)。

假單胞菌的測定:涂布CFC假單胞菌選擇性培養(yǎng)基平板25℃培養(yǎng)48 h計數(shù)。

芽孢桿菌的測定:將菌液經(jīng)過80℃水浴處理15 min，迅速冷卻后涂布營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板37℃培養(yǎng)48 h計數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)采用Excel進行處理，DPS7.05進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品理化指標(biāo)的分析

對所采集樣品進行pH值、酸度、鹽度測定，其測定結(jié)果見表2?？梢钥闯?，不同原料之間的各項理化指標(biāo)差異明顯，其中，13種傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜水的總酸含量、食鹽含量分別在0.59～1.07 g/100 g，3.16%～13.86%;16種企業(yè)鹽漬水樣品的總酸含量、食鹽含量分別在0.17～0.88 g/100 g，4.50% ～15.47%。由于蔬菜生產(chǎn)的季節(jié)性，生產(chǎn)商在生產(chǎn)中會采用控制蔬菜不同鹽漬池鹽度的方法來控制其發(fā)酵成熟時間，以保證不同時間段的產(chǎn)品供應(yīng)。

另外，從表2也可以看出，同在泡菜企業(yè)A生產(chǎn)的“已鹽漬60 d”的第20～23號樣品的蘿卜鹽漬水的酸度和鹽度，以及同在泡菜企業(yè)B生產(chǎn)的“已鹽漬60 d”的第26－29號樣品的青菜鹽漬水的酸度和鹽度均表現(xiàn)出較大的差異，這可能是因為泡菜企業(yè)生產(chǎn)鹽漬菜時根據(jù)蔬菜原料的差異來調(diào)節(jié)食鹽的用量以控制鹽漬發(fā)酵的進度，這也可能使企業(yè)的同類鹽漬菜的質(zhì)量不夠穩(wěn)定。

表2 樣品的pH、酸度和鹽度的測定結(jié)果Table 2 Results of pH，acidity and salinity of the samples

表3 樣品的pH、酸度和鹽度之間的相關(guān)性Table 3 The correlation between pH or acidity and salinity of the samples

從樣品的鹽度、pH值和酸度之間的相關(guān)性分析結(jié)果(表3)可以看出，對于低鹽發(fā)酵泡菜水，其發(fā)酵鹽度與樣品pH、酸度之間存在顯著相關(guān)性，而對于高鹽發(fā)酵泡菜水，其發(fā)酵鹽度對樣品的pH、酸度卻沒有顯著相關(guān)的關(guān)系。這可能是因為在低鹽環(huán)境下，乳酸菌等微生物的活動相對旺盛而且其受食鹽含量的影響明顯;而在鹽度偏高的情況下，多數(shù)微生物(包括一些乳酸菌)的活動受到了抑制;另外，也可能是因為所采集的樣品的蔬菜原料不同而導(dǎo)致其產(chǎn)品特征出現(xiàn)差異，也可能是因為這些傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜大部分都是小戶型制作模式，因個人操作的差異而使得產(chǎn)品理化特征各不相同。

從表3還可以看出，企業(yè)鹽漬水樣的發(fā)酵鹽度與樣品酸度之間始終呈現(xiàn)出一種顯著的相關(guān)性關(guān)系，這也表明只要企業(yè)準(zhǔn)確控制了蔬菜鹽漬池的鹽度，即能夠很好地掌控蔬菜的成熟時間，有利于企業(yè)的生產(chǎn)計劃安排。

2.2 傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜水樣品中微生物類群及其數(shù)量分析

對傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜水分別進行菌落總數(shù)、乳桿菌、乳球菌、明串珠菌、醋酸菌、假單胞菌、芽孢桿菌、酵母菌及霉菌的測定，其計數(shù)分析結(jié)果如表4所示。

表4 傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜水樣品的微生物指標(biāo)值CFU/mLTable 4 Microorganism index of the traditional fermenting pickle samples CFU/mL

從表4可以看出，在大部分泡菜水樣品中的乳桿菌、乳球菌、明串珠菌的含量均較高，其中以乳桿菌占優(yōu)勢，如第3號樣品中的乳桿菌含量高達(dá)6.8×107CFU/mL，第4號樣品的乳桿菌含量則高達(dá)1.2×108CFU/mL，再次證實乳桿菌、乳球菌和明串珠菌等屬細(xì)菌是傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜在發(fā)酵過程中的主要微生物［16］;同時，不同傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜水中的乳桿菌、乳球菌、明串珠菌的含量差異明顯，尤其是明串珠菌的含量隨著泡菜水樣品的不同而變化，有的樣品中明串珠菌含量高達(dá)2.7×106CFU/mL，而在有的樣品中明串珠菌含量低至47 CFU/mL，這可能是因為明串珠菌的生長可能會受到泡菜原輔料、生產(chǎn)地域、溫度、鹽度和酸度等的影響，正如Albury［17］在酸黃瓜研究中的發(fā)現(xiàn)——明串珠菌啟動泡菜發(fā)酵;隨著產(chǎn)酸的增加，片球菌、乳桿菌占優(yōu)勢;在長期發(fā)酵蔬菜的發(fā)酵后期中有見鏈球菌屬細(xì)菌出現(xiàn)。檢測發(fā)現(xiàn)所采集的傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜水樣品的pH值范圍為3.35～4.48，總酸含量范圍為 0.59 ～1.07 g/100g，食鹽含量范圍為3.16%～13.86%。然而傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜水中仍有大量乳酸菌存活，說明泡菜發(fā)酵過程中所涉及到的乳酸菌具有較強的抗酸能力以及耐鹽性。本實驗收集保存了若干份分離自所采集樣品的乳酸菌菌株，為后續(xù)泡菜專用功能菌種的篩選提供了菌種來源。關(guān)于以青菜、蘿卜、辣椒、豇豆、白菜等為原料的泡菜發(fā)酵過程中的微生態(tài)區(qū)系分布和變化趨勢，有待進一步研究。

同時，酵母菌存在于大多數(shù)的樣品中，某些樣品中酵母菌含量還高達(dá)106CFU/mL(如第7號樣品);在少數(shù)樣品中還存在少量的醋酸菌(如第1、8號樣品)。有研究［18］表明，酵母菌在泡菜發(fā)酵過程中較活躍，發(fā)酵性酵母可在整個主發(fā)酵及二次發(fā)酵階段生長，酵母菌可以通過代謝產(chǎn)生酒精以及一些酯類香味成分。少量的醋酸菌在有氧的條件下，將酒精轉(zhuǎn)化成醋酸，進而轉(zhuǎn)化成乙酸乙酯，適量的醋酸菌及其活動對泡菜是有利的。然而，酵母發(fā)酵不加以控制，則可能損害泡菜產(chǎn)品的風(fēng)味［12］;過量的醋酸也會使泡菜產(chǎn)生不愉快的氧化味道［11］。

從表4中數(shù)據(jù)還可以看出，四川傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜水樣品均受到一定程度的微生物污染——假單胞菌在大部分樣品中被檢出，污染嚴(yán)重的傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜水中的假單胞菌含量達(dá)到104CFU/mL;而且芽孢桿菌也存在于多個傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜水樣品中，這可能是由于其自身特殊的生理結(jié)構(gòu)和耐酸、耐鹽的特點而具有較強的生存能力;另外，有少數(shù)傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜樣品還受到了霉菌污染，這些污染微生物可能造成泡菜產(chǎn)品長膜或腐敗變質(zhì)。

2.3 企業(yè)鹽漬水樣品中微生物類群及其數(shù)量分析

對企業(yè)鹽漬池鹽漬水分別進行菌落總數(shù)、乳酸菌、酵母菌及霉菌的測定，結(jié)果如表5所示。

表5 鹽漬水樣品的微生物指標(biāo)值CFU/mLTable 5 Microorganism index of the enterprise's saline water samples CFU/mL

從表5中可以看出，企業(yè)鹽漬水樣中菌落總數(shù)在102～105CFU/mL之間，乳酸菌數(shù)在10～105CFU/mL，酵母菌數(shù)在10～105CFU/mL，這說明乳酸菌和酵母菌都是鹽漬菜生產(chǎn)過程中的主要微生物。此外，一些樣品中有霉菌檢出。

將蔬菜原料和發(fā)酵時間均相同的同一泡菜企業(yè)中的不同鹽漬池的鹽漬水樣品(即泡菜企業(yè)A鹽漬60 d的第20～23號蘿卜鹽漬水、泡菜企業(yè)B鹽漬60 d的第26～29號青菜鹽漬水)的菌落總數(shù)、乳酸菌和酵母菌3項微生物指標(biāo)，與其相應(yīng)的pH、酸度和鹽度3個理化指標(biāo)之間進行相關(guān)性分析，結(jié)果如表6所示。

表6 部分鹽漬水樣品的微生物指標(biāo)與其理化指標(biāo)的相關(guān)性Table 6 The correlateion between Microorganism index and physicochemical index of some saline water samples

從表6可以看出，鹽漬水樣品中的鹽度與其中的微生物指標(biāo)值呈顯著相關(guān)性，說明食鹽含量對鹽漬發(fā)酵過程中的蔬菜中的微生物指標(biāo)值影響很大，當(dāng)食鹽含量較低時鹽漬蔬菜中的微生物數(shù)量較多;而微生物數(shù)量又與樣品pH值、酸度密切相關(guān)，當(dāng)乳酸菌及酵母菌數(shù)越多時蔬菜鹽漬水樣品的pH值越低、酸度越高。這在一定程度上解釋了蔬菜發(fā)酵過程中的pH、酸度和鹽度3個理化指標(biāo)之間互相制約的關(guān)系。

然而，正如四川傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜水中存在乳桿菌、乳球菌、明串珠菌等多種乳酸菌一樣，企業(yè)鹽漬菜的鹽漬水中也可能存在著一定數(shù)量的多種乳酸菌，所以，對于泡菜企業(yè)中的蔬菜鹽漬水的微生態(tài)區(qū)系分布和鹽漬水的pH值、酸度、鹽度、鹽漬時間等的關(guān)系，還有待進一步深入研究，從而為泡菜企業(yè)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)鹽漬蔬菜的標(biāo)準(zhǔn)化提供理論依據(jù)或參考。

如果要將上述對四川泡菜微生態(tài)菌群分布的分析結(jié)論應(yīng)用到解決企業(yè)泡菜生產(chǎn)中的實際問題，真正探明導(dǎo)致泡菜變色、軟化、生花等變質(zhì)現(xiàn)象的微生物學(xué)原因，還需進一步對其生花菌、軟腐菌(假單胞菌、芽孢桿菌、霉菌)分別進行分離純化鑒定，再進行針對性的防止與控制。

3 結(jié)論

本實驗以四川傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜以及企業(yè)鹽漬菜為研究對象，測定分析了其pH值、酸度及鹽度指標(biāo);采用不同的選擇性培養(yǎng)基對樣品乳酸菌區(qū)系、細(xì)菌菌落總數(shù)、酵母菌數(shù)、霉菌數(shù)、醋酸菌以及假單胞菌、芽孢桿菌進行了測定與分析。結(jié)果顯示:

(1)傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜樣品中的乳桿菌、乳球菌、明串珠菌的含量均較高，有的甚至達(dá)到108CFU/mL;大部分傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜樣品水中的酵母菌含量較高，在102～106CFU/mL;少量泡菜水樣品中存在醋酸菌。企業(yè)鹽漬菜樣品中菌落總數(shù)在102～105CFU/mL，乳酸菌數(shù)和酵母菌數(shù)均在10～105CFU/mL。由此說明，無論是傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜，還是企業(yè)鹽漬菜，無論采用什么蔬菜原料，乳酸菌和酵母菌都是其發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌株。

(2)樣品中的食鹽含量對微生物指標(biāo)影響很大，而微生物的數(shù)量又與樣品pH、酸度密切相關(guān)。

(3)少數(shù)樣品受到霉菌污染，大多數(shù)的傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜樣品受到了一定程度的假單胞菌或芽孢桿菌的污染。

［1］ 任俊琦.發(fā)酵泡菜低溫保藏微生物變化規(guī)律研究［D］.重慶:西南大學(xué)，2010.

［2］ Ennahar S，Sonomoto K，Ishizaki A.Class IIa bacteriocins from lactic acid bacteria:Antibacterial activity and food preservation［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，1999，87(6):705－716.

［3］ Huang Y，Luo Y B，Zhai Z Y，et al.Characterization and application of an anti-Listeria bacteriocin produced by Pediococcus pentosaceus 05－10 isolated from Sichuan Pickle，a traditionally fermented vegetable product from China［J］.Food Control，2009，20(11):1 030－1 035.

［4］ 陳功.中國泡菜的品質(zhì)評定與標(biāo)準(zhǔn)探討［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(2):335－338.

［5］ 趙麗珺，齊鳳蘭，陳有容.泡菜研究現(xiàn)狀及展望［J］.食品研究與開發(fā)，2004，25(3):21－24.

［6］ Ariana D P，Lu R.Evaluation of internal defect and surface color of whole pickles using hyperspectral imaging［J］.Journal of Food Engineering，2010，96(4):583－590.

［7］ 蘇揚，陳云川.泡菜的風(fēng)味化學(xué)及呈味機理的探討［J］.中國調(diào)味品，2001(4):28－31

［8］ 王曉飛.純種發(fā)酵泡菜及其風(fēng)味物質(zhì)的研究［D］.南京:南京工業(yè)大學(xué)，2005.

［9］ 楊瑞，張偉，陳煉紅，等.發(fā)酵條件對泡菜發(fā)酵過程中微生物菌系的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(3):90－92.

［10］ Maklon K，Minami A，Kusumoto A，et al.Isolation and characterization of Listeria monocytogenes from commercial asazuke(Japanese light pickles)［J］.International Journal of Food Microbiology，2010，139(3):134－139.

［11］ 張鵬.四川泡菜中酵母菌的分離篩選及其應(yīng)用研究［D］.哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［12］ 鄯晉曉.四川泡菜菌系分離、篩選及發(fā)酵劑的研究［D］.重慶:西南大學(xué)，2008.

［13］ 凌代文，東秀珠.乳酸細(xì)菌分類鑒定及實驗方法［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1999.

［14］ 張剛.乳酸細(xì)菌基礎(chǔ)、技術(shù)和應(yīng)用［M］.北京:北京化學(xué)工業(yè)出版社，2007

［15］ 張永鳳，盧紅梅，張鳳娟，等.優(yōu)良醋酸菌的分離純化［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28(10):89－91.

［16］ Xiong T，Guan Q Q，Hao M Y，et al.Dynamic changes of lactic acid bacteria flora during Chinese sauerkraut fermentation［J］.Food Control，2012，26(1):178 － 181.

［17］ Albury M N.Factors affecting the bacterial flora in fermenting vegetabales［J］.Food Reserch，1953，18(2):290－300.

［18］ Chang H W，Kim K H，Nam Y D，et al.Analysis of yeast and archaeal population dynamics in kimchi using denaturing gradient gel electrophoresis［J］.International Journal of Food Microbiology，2008，126(1/2):159 －166.