李紅梅等
摘要:豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是世界上主要的豬傳染性疾病之一,以妊娠母豬發(fā)熱、厭食、早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎等繁殖障礙及仔豬高死亡率和育成豬呼吸困難,類流感癥狀、發(fā)育遲緩為主要的特征。該病給各個(gè)國(guó)家的養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失,目前,疫苗和抗病毒藥物只能提供有限的保護(hù)。自2006年以來,不斷有研究者應(yīng)用RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)開展抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的研究,并取得了一些階段性成果。對(duì)已有的研究成果進(jìn)行了綜述。
關(guān)鍵詞:豬繁殖與呼吸綜合征病毒;RNAi;抗病毒
中圖分類號(hào):S852.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B 文章編號(hào):1007-273X(2013)05-0061-04
豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV) 屬套式病毒目(Nidovirales) 動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae) 動(dòng)脈炎病毒屬(Arterivirus) 成員[1],是一種有囊膜的單鏈正股 RNA 病毒。該病毒可持續(xù)性感染豬,引起免疫抑制,目前此病已經(jīng)成為危害世界養(yǎng)豬業(yè)安全的重要病原之一[2]。近年來,PRRSV 病毒的變異導(dǎo)致高致病性PRRSV的出現(xiàn),給中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來致命的災(zāi)難。然而,目前使用的 PRRSV 疫苗只能部分阻止臨床癥狀的出現(xiàn),不能防治 PRRSV 感染,另外不同毒株間的交叉保護(hù)力也較低,因此人們對(duì)新型防控策略的研發(fā)充滿了期待。
RNA干擾 (RNA interference,RNAi) 是由小干擾 RNA (small interfering RNA,siRNA) 或微 RNA (microRNA,miRNA) 所引起的以序列特異性方式介導(dǎo)的靶 mRNA 降解或翻譯抑制的基因調(diào)控方式[3],同時(shí)又是一種保守的抗病毒機(jī)制。近年 RNAi 技術(shù)已被用于干擾抑制多種人或畜類病毒的復(fù)制和感染研究。與傳統(tǒng)疫苗預(yù)防和藥物治療相比,由于 RNAi 技術(shù)能夠從源頭上有效地抑制病毒抗原基因的表達(dá),因此 RNAi 也許是一種更有效的抗病毒策略,尤其是在動(dòng)物傳染性疾病的防治方面,越來越多的證據(jù)也表明,RNAi 是生物體內(nèi)一種古老而保守的抗病毒免疫形式。
對(duì)病毒而言,無論是 DNA 還是 RNA 病毒,只要其在細(xì)胞中經(jīng)歷 RNA 的階段,都可能成為 RNAi 的靶標(biāo)。RNAi主要抗病毒機(jī)制為:病毒在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制會(huì)產(chǎn)生 dsRNA 復(fù)制中間體,作為激活 RNAi 的作用因子,這些中間體經(jīng)加工后形成沉默復(fù)合體,特異性地與目的病毒 RNA 或 mRNA 結(jié)合,并將其降解[4]。眾多的研究已表明特異性 siRNAs 介導(dǎo)的 RNAi 可以抑制病毒的復(fù)制、減少病毒 RNA 的數(shù)量和阻斷病毒蛋白的表達(dá),在病毒病的治療上顯示出一定效果[5,6]。但是病毒的進(jìn)化和快速變異使其干擾 siRNA 和微 RNA(miRNA) 介導(dǎo)的沉默通路的能力也越來越強(qiáng),在宿主細(xì)胞內(nèi)病毒和宿主細(xì)胞 RNAi 的抑制作用展開了“博弈”,病毒只有能夠逃逸宿主細(xì)胞 RNAi 這種基于核酸的免疫系統(tǒng)方能生存[7]。
病毒逃避 RNAi 的可能分子機(jī)制:一般來說,RNA 病毒主要通過靶區(qū)域的突變或編碼病毒抑制子來逃避 RNAi 介導(dǎo)的抑制,或兩者兼有,而 DNA 病毒則傾向于利用病毒抑制子逃避宿主 RNAi[8,9]。理解了病毒逃避 RNAi 的分子機(jī)制,我們才能更好的設(shè)計(jì)避免病毒產(chǎn)生抗性的高效 RNAi 片段。
1 microRNA(miRNA) 抑制PRRSV的相關(guān)研究進(jìn)展
近年來,Xiao 等[10]對(duì)人工合成的microRNAs在MARC-145細(xì)胞中抑制高致病性PRRSV的復(fù)制進(jìn)行了研究,該研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了分別靶向H-PRRSV主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5、M蛋白編碼基因的5個(gè)amiRNAs,即基于小鼠miR-155設(shè)計(jì)的由PolII啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的pre-amiRNA表達(dá)載體上,使得這些amiRNAs能夠像內(nèi)源性的microRNA一樣被加工成熟。結(jié)果5個(gè)amiRNAs對(duì)靶基因表達(dá)的抑制效率均在70%以上。amirGP5-370能在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平有效抑制靶基因的表達(dá),并能抑制H-PRRSV在MARC-145細(xì)胞中的復(fù)制。當(dāng)amirM-263與其自身串聯(lián)一次后置于同一個(gè)表達(dá)框中時(shí),串聯(lián)表達(dá)的amirM-263能有效抑制H-PRRSV感染過程中靶基因的表達(dá)和病毒復(fù)制。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明,串聯(lián)表達(dá)amirGP5370和amirM-263能夠同時(shí)抑制GP5與M蛋白編碼基因表達(dá)。
Xia 等[11]也針對(duì)PRRSV的5' 或 3' UTR非翻譯區(qū),人工合成6個(gè)microRNAs進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有4個(gè)amicroRNAs能有效抑制PRRS病毒的復(fù)制。microRNA的研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步提高了RNAi的有效性。利用內(nèi)源性microRNA的表達(dá)調(diào)控來控制PRRSV的發(fā)展是一條新的途徑。
2 RNAi 在抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒方面的研究
2.1 針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF1的RNAi的研究進(jìn)展
做RNAi 實(shí)驗(yàn)中,在選取目的基因時(shí),應(yīng)選取保守的、并對(duì)病毒生長(zhǎng)繁殖影響大的基因,該基因不能與宿主基因有同源性,從而在預(yù)防和治療病毒性疾病上才能發(fā)揮作用。
在不同的毒株之間 ORF1b 比 ORF1a 更保守。所以針對(duì) ORF1 設(shè)計(jì)的干擾靶位一般選在 ORF1b 區(qū)。通過文獻(xiàn)整理發(fā)現(xiàn),目前共有2個(gè)研究團(tuán)隊(duì)針對(duì) PRRSV 的 ORF1b 保守區(qū)域設(shè)計(jì)了干擾片段,Li等[12-14]針對(duì) PRRSV S1株設(shè)計(jì)的 pSUPER-P2 和 pSUPER-P3 的 shRNA 表達(dá)質(zhì)粒,在 MARC-145上明顯抑制了 PRRS 病毒的復(fù)制,且 ORF1b 編碼的基因和蛋白的表達(dá)都下調(diào)幾十倍,結(jié)果證明 ORF1b 編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)在 PRRSV 復(fù)制過程中起到了重要作用。 同時(shí)他們又將 pSUPER-P2 和 pSUPER-P3克隆到腺病毒載體上,轉(zhuǎn)染感染 PRRSV 的 MARC-145 和豬肺巨噬細(xì)胞(PAM),結(jié)果2個(gè) shRNA 重組腺病毒組中 TCID50、靶基因 mRNA 和蛋白質(zhì)水平均明顯低于 PRRSV 對(duì)照組,對(duì)病毒復(fù)制的抑制效力為100~1 000倍。ORF1b 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的減少可以直接影響病毒在感染早期結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)與合成,從而影響到病毒粒子的裝配。而且 rAd-P2 可以在豬體內(nèi)有效抑制 PRRSV 的復(fù)制,推遲動(dòng)物發(fā)病3 d左右。證明 shRNA 重組腺病毒在體內(nèi)外均能有效抑制 PRRSV 復(fù)制,為控制 PRRSV 感染提供了一種可能的新策略[14]。Bao 等[15]也針對(duì) PRRSV-JXwn06 的 ORF1b 設(shè)計(jì)5 對(duì)干擾片段,結(jié)果篩選到2 對(duì)有效片段 pGenesil-1-1b-135 和 pGenesil-1-1b-372,這進(jìn)一步證明 ORF1b 編碼基因和蛋白的功能,同時(shí)也證明了靶位點(diǎn)的選擇影響 RNAi 的效果。
2.2 針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組次要結(jié)構(gòu)蛋白的RNAi的研究進(jìn)展
GP2、GP2b、GP3和GP4 是次要的結(jié)構(gòu)蛋白,針對(duì) PRRSV 的次要結(jié)構(gòu)蛋白的 RNAi 比較少,國(guó)內(nèi)研究團(tuán)隊(duì)主要是賀云霞等[16]針對(duì) PRRSV CH-1a 分離株(GenBank 登錄號(hào) AY032626)的 GP2、GP3、GP4 蛋白區(qū)構(gòu)建了12個(gè)短發(fā)夾結(jié)構(gòu)表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染 MARC-145 細(xì)胞,結(jié)果篩選到5對(duì)能明顯抑制病毒復(fù)制的片段,但 ORF2、ORF3 或 ORF4 的減少并未明顯影響病毒粒子的組裝,不過減少 GP3 mRNA 能夠影響感染細(xì)胞中的病毒滴度,表明 GP3 在 PRRSV 復(fù)制或感染中有重要作用。
2.3 針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組主要結(jié)構(gòu)蛋白的RNAi的研究進(jìn)展
GP5、 M 和 N 是主要的結(jié)構(gòu)蛋白,且它們?cè)谡麄€(gè)病毒復(fù)制中起重要作用,且在同一基因型毒株間相對(duì)保守。因此研究者在設(shè)計(jì)針對(duì) PRRSV 的干擾實(shí)驗(yàn)時(shí),主要以 GP5、M 和 N 蛋白基因作為靶標(biāo)。
PRRSV GP5 蛋白是由 ORF5 編碼的 PRRSV 最重要結(jié)構(gòu)蛋白, 也是變異性較高的糖蛋白, 其 N 端有一個(gè)信號(hào)肽, 是 GP5 的高變異區(qū)。有關(guān) PRRS 病毒致病機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn),克隆于哺乳動(dòng)物痘病毒載體的 ORF5 表達(dá)產(chǎn)物可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,表明 GP5 蛋白可能與疾病發(fā)生有關(guān)[17,18]。
Wissink等[19] 研究發(fā)現(xiàn) PRRSV 病毒體的形成依賴于GP5、M 這兩個(gè)主要包膜蛋白,如缺少它們,就不能釋放出病毒粒子。研究者們針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒( PRRSV) JL/ 07/ SW 株、PRRSV -S 1株和 PRRSV-JXwn06 株 GP5 基因設(shè)計(jì)了干擾靶位,結(jié)果證實(shí)構(gòu)建的部分干擾質(zhì)??梢愿咝б种?PRRSV 在 MARC-145 細(xì)胞中的復(fù)制, 說明 GP5 基因是 PRRSV 復(fù)制所必需的[12,15,20 ,21]。
基質(zhì)蛋白(M蛋白)由 ORF6 編碼是歐美毒株之間較為保守的蛋白[9]。黃娟[22]和 Bao 等[15]研究團(tuán)隊(duì)也針對(duì)不同毒株株的 ORF6 區(qū)設(shè)計(jì)了干擾片段。最終都篩選到有效抑制 PRRSV 復(fù)制的片段。Xiao等[10]則利用慢病毒載體構(gòu)建的對(duì)抗GP5和M蛋白的amiRNA能夠抑制高致病性的PRRSV在MARC-145細(xì)胞中的復(fù)制。這一發(fā)現(xiàn)表明豬體內(nèi)可能存在一類能夠抑制PRRSV復(fù)制的microRNAs,或者PRRSV本身可能編碼microRNA。我們通過調(diào)節(jié)豬內(nèi)源性microRNA的表達(dá)量或者抑制病毒本身編碼的microRNA的表達(dá),都有可能從根本上抑制各類PRRSV毒株的復(fù)制,找到治療PRRS的治療藥物和方法。
ORF7 編碼病毒的核衣殼蛋白(N) 。在 PRRSV 感染細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平最高,占病毒粒子總蛋白量的20%~40%,是病毒的優(yōu)勢(shì)結(jié)構(gòu)蛋白。 且在歐、美2種基因型中,N 蛋白高度保守[23]。且如果抑制其表達(dá)整個(gè) PRRSV 粒子將不能夠包裝成功[24]。
黃娟[22]構(gòu)建了4個(gè)靶向 PRRSV N蛋白基因的 shRNA 表達(dá)質(zhì)粒,結(jié)果表明pSUPER-N3 對(duì) PRRSV 的復(fù)制有明顯的抑制效果。將這兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 MARC-145 細(xì)胞,發(fā)現(xiàn) shRNA 表達(dá)質(zhì)粒對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用具有相加性,而且用 shRNA 表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染已經(jīng)感染 PRRSV 的 Marc-145 細(xì)胞,病毒的復(fù)制也得到了抑制。研究人員還發(fā)現(xiàn)針對(duì)N基因的干擾片段可有效抑制病毒復(fù)制的片段,證實(shí) N 基因可能是病毒復(fù)制所必需的結(jié)構(gòu)基因[25,26,10,27-29,]。
2.4 針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組3'UTR 和5'UTR的RNAi的研究進(jìn)展
黃娟[22]還通過干擾實(shí)驗(yàn)證實(shí)針對(duì) PRRSV 的 5'UTR 設(shè)計(jì)的干擾片段對(duì)病毒復(fù)制的影響并不顯著。但是,Xia等[11]則針對(duì)PRRSV- VR2332 (ATCC VR2332),PRRSV-CH-1R,PRRSV- JXA1的3'UTR 和5'UTR在體外人工合成6個(gè)amicroRNA干擾片段,結(jié)果有4個(gè)amicroRNAs有效地抑制了PRRSV病毒的復(fù)制。這與小siRNA干擾結(jié)果是不同的,但這并不矛盾。因?yàn)槲覀冎溃瑂hRNA編碼的siRNA需要與其綁定的靶位點(diǎn)序列完全匹配才能發(fā)揮作用,而microRNA與其靶序列的作用只需要8個(gè)種子堿基配對(duì)即可。同時(shí)也說明microRNA具有更強(qiáng)的干涉病毒復(fù)制的效果。盡管之前的研究表明針對(duì)PRRSV編碼區(qū)抑制病毒復(fù)制的效果是非常顯著的,但從遺傳學(xué)角度講,每種基因型的病毒在序列和毒力方面的變異速度是非??斓摹5峭换蛐偷牟《痉蔷幋a區(qū)卻是相對(duì)保守的,序列同源性也較高。如果我們能針對(duì)PRRSV不同毒株相對(duì)保守的非編碼區(qū)設(shè)計(jì)穩(wěn)定表達(dá)的干擾序列,那么就有可能建立更全面的抗PRRSV不同毒株感染的戰(zhàn)略方法。
3 展望
RNAi 作為一項(xiàng)新技術(shù),已經(jīng)成為研究基因功能的新工具,研究信號(hào)傳導(dǎo)通路的新途徑,開展基因治療的新策略。RNAi 有抵抗病毒入侵,抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)等作用,因此可以利用 RNAi 現(xiàn)象產(chǎn)生抗病毒的植物和動(dòng)物,并可利用不同病毒轉(zhuǎn)錄序列中高度同源區(qū)段相應(yīng)的 dsRNA 抵抗多種病毒。
盡管RNAi技術(shù)在抗病毒感染方面己顯示出廣闊的應(yīng)用前景,但目前對(duì)RNAi機(jī)制尚不完全清楚,比如RISC的形成、組成成分、如何切割mRNA; siRNA靶位點(diǎn)的選擇;siRNA的穩(wěn)定性以及對(duì)正常細(xì)胞有無影響;外源siRNA怎樣適時(shí)、適地、安全的導(dǎo)入機(jī)體靶器官并被組織細(xì)胞攝取,這些問題都有賴于RNAi的進(jìn)一步發(fā)展。
目前,人工體外合成的microRNA對(duì)PRRSV的抑制作用,為針對(duì)PRRSV的RNAi研究帶來新的希望。microRNA是一個(gè)龐大的小分子調(diào)控RNA家族,廣泛存在于各種動(dòng)植物中,參與細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞凋亡、胚胎發(fā)育、形態(tài)建成以及疾病發(fā)生等一系列重要的生命過程。相信RNAi中存在的一系列問題將不斷地得到解決。內(nèi)外源性的RNAi 作為新的基因治療劑都將更加廣泛地應(yīng)用于動(dòng)物乃至人畜共患疾病的治療中,真正實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用, 最終成為防治動(dòng)物疫病的有效手段。也許在1~2年內(nèi),我們就有可能看到基于microRNA的治療方法。
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