油污土壤植物與真菌聯(lián)合生物修復的研究

于會佳　楊麗娜　孟天天　黃依玲

摘 要：利用具有石油烴降解能力的真菌與植物復配，探討不同植物與真菌聯(lián)合修復油污土壤的效果。將4種植物（玉米、玉米草、黑麥草、紫花苜蓿）與2種真菌（Fungal sp.、Stachybotrys sp.）在5種濃度油污土壤（0.1%，0.5%，1%，1.5%，2.0%）中進行單接種及雙接種種植試驗，以7 d為單位測定石油烴降解率，篩選出對各濃度油污土壤修復效果最佳的復配方案。結果表明，玉米、玉米草和黑麥草單接種處理原油降解效果較好，且在油污濃度為1%時，3種植物均達到最高的降解效率。當油污濃度高于1.5%時，紫花苜蓿混合接種處理對油污的降解率明顯升高，最大可達到87%。紫花苜蓿在混合接種條件下更適合高濃度油污土壤的生物修復，推廣價值更大。

關鍵詞：油污土壤；植物-真菌聯(lián)合修復；單接種；混合接種

中圖分類號：X172 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.05.018

在原油的開采、運輸、使用以及石油產(chǎn)品的加工和生產(chǎn)過程中，不可避免的泄露對環(huán)境造成了嚴重的危害，尤其是對土壤。原油的成分復雜，包括直鏈烷烴、支鏈烷烴、多環(huán)芳烴（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs）等多種化學成分，其中16種多環(huán)芳烴已被世界環(huán)境衛(wèi)生組織列為具有高度危害的環(huán)境污染物之一。多環(huán)芳烴在生成、遷移、轉化和降解的過程中，通過呼吸道、皮膚、消化道進入人體，極大地威脅著人類的健康，有很強的致畸、致癌、致突變作用[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，細菌、真菌、藻類都具有降解多環(huán)芳烴的能力，隨著PAHs苯環(huán)數(shù)量的增加，其降解速率也越來越低，所以低分子量的PAHs在環(huán)境中能較快地降解，存在的時間短；而高分子量的PAHs難于降解[5]。

植物-微生物聯(lián)合治理環(huán)境污染是近年來人們研究的熱點，其高效、簡便、無二次污染的優(yōu)點是其被廣為采納的重要原因。胡長慶等[6-7]從油污土壤及海水中分離出了3種絲狀石油降解真菌，在實驗室的模擬污染土壤修復試驗中均表現(xiàn)出了良好的石油降解能力，并探索了復合菌群最佳原油降解條件。筆者利用已篩選出的能夠有效降解石油烴的2種真菌以及適應北方寒冷氣候的植物，研究真菌與植物聯(lián)合對土壤中石油污染的修復效果，并尋找二者的最佳組合及實施方案，在修復土壤中污染物的同時，恢復污染土壤的植被，達到污染土壤生態(tài)修復、改善土壤微環(huán)境的目的。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 植物與真菌 選取適宜北方寒冷地區(qū)生長的4種禾本科與豆科植物，分別為玉米、玉米草、黑麥草和紫花苜蓿。種子由大慶市種子公司提供。供試真菌為已鑒定具有較好石油烴降解能力的真菌（Fungal sp.）和葡萄穗酶菌（Stachybotrys sp.），以下用H3和H4代替，菌種經(jīng)活化，在CPDA平板上擴大培養(yǎng)后作為供試菌劑。

1.1.2 油污土壤 采集大慶地區(qū)星火牧場5～10 cm土層土壤，陰涼處風干，過4 mm篩，去除草根、枯草等。將取自大慶油田的原油在90 ℃蒸發(fā)3 h，去除易揮發(fā)的短鏈烴后[8]，用適量石油醚溶解配制成10%的原油原液，與風干的土壤混勻，配制成濃度分別為0.1%，0.5%，1%，1.5%，2%的油污土壤，分裝到直徑10 cm的營養(yǎng)缽中，待用。

1.2 方 法

1.2.1 種子的處理 4種植物的種子在0.05%的高錳酸鉀溶液中浸泡1 h，洗掉高錳酸鉀溶液后用蒸餾水沖洗3遍，洗凈種子表面的高錳酸鉀溶液。將種子放在濕潤的脫脂棉上，放入恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃誘導發(fā)芽48 h后播種。每個營養(yǎng)缽中播種15粒，表面覆土約1 cm。

1.2.2 制備菌塊 將無污染的H3、H4固體菌種連同培養(yǎng)基切成1 cm×1 cm的小正方形，接種到新配制的CPDA固體培養(yǎng)基上，26 ℃倒置培養(yǎng)。待長滿平板后，選擇滅菌直徑為1 cm的打孔器進行打孔，從打孔器中取出菌塊接種于油污土壤中。

1.2.3 不同接種方式的原油降解試驗 選取油污濃度為1%的土壤，對4種植物分別進行不同接種方式的原油降解試驗，即玉米、玉米草、黑麥草和紫花苜蓿四種植物與H3單接種，與H4單接種，與H3、H4混合接種進行原油降解實驗。在種子長出子葉后的第7，14，21，28，35天分別測定原油降解率，探討接種方式對植物-真菌聯(lián)合修復的影響。

1.2.4 不同油污濃度的原油降解試驗 4種植物均采用混合接種方式即H3和H4聯(lián)合接種，接種于5種油污濃度的土壤中進行原油降解試驗，在種子長出子葉后的第7，14，21，28，35天分別測定原油降解率，探討植物-真菌在不同油污濃度下的降解效果。

1.2.5 原油降解率測定 對每個處理分別在第7，14，21，28，35天時，取土樣約5 g，用脫脂濾紙包好，烘干樣品至恒質量，稱質量。采用有機溶劑超聲波萃取法提取總烴，步驟如下：土樣放入50 mL離心管中，加入石油醚10 mL，震蕩混勻，超聲波萃取10 min，4 000 r·min-1離心5 min，棄上清，重復1次；加入二氯甲烷10 mL，超聲波萃取10 min，4 000 r·min-1離心5 min，棄上清；加入三氯甲烷10 mL，超聲波萃取10 min，4 000 r·min-1離心5 min，棄上清，取出萃取后的土樣，烘干至恒質量，用重量法測定原油的含量[9]，計算原油降解率，公式如下：

原油降解率=×100%

式中，m0為最初原油質量（mg）；m1為樣品處理后的原油質量（mg）；m2為空白樣品中損失的原油質量（mg）。

2 結果與分析

2.1 不同接種條件下植物與真菌聯(lián)合降解的效果

選取1%油污濃度的土壤對4種植物與H3、H4分別進行單接種和混合接種試驗，在第7，14，21，28，35天根據(jù)公式測定原油降解率。玉米、玉米草和黑麥草這3種植物在油污濃度為1%，單接種條件下的原油降解率均大于混合接種（圖1～3），玉米草和黑麥草與H3單接種的最終原油降解率稍高，而玉米與H4單接種處理對油污的降解率最大（86%），說明H4（葡萄穗酶菌Stachybotrys sp.）與玉米根系形成了良好的互惠共生體系，其根在土壤中生長、伸長會疏松土壤，為單一菌種的真菌利用石油創(chuàng)造有利條件，同時真菌的代謝產(chǎn)物能提高土壤中堿性磷酸酶的活性，促進玉米對磷的吸收而增進玉米生物量[10]。而紫花苜蓿與H3和H4混合接種的降解效果明顯高于單接種處理，且達到了幾種處理中最高的降解率（88.7%）（圖4）。紫花苜蓿屬豆科植物，由于其根系發(fā)達而對逆境耐受能力較強，豆科植物根際分泌物中含有堿性磷酸酶成分，而磷素是根瘤固氮必需的[11-12]，真菌侵入根瘤內(nèi)部[13]，對提高吸收磷素十分有利。真菌、紫花苜蓿與根瘤菌互惠共生，在土壤微環(huán)境中相得益彰[14]。

2.2 油污濃度對植物與真菌聯(lián)合降解原油的影響

如圖5所示，在土壤油污濃度為0.5%～1.5%之間時，玉米的混合接種聯(lián)合處理比另外3種植物具有較高的降解率，而在油污濃度較高的2%土壤中，紫花苜蓿表現(xiàn)出了良好的降解效果，而最終降解率可達87%。從整體趨勢看，玉米、玉米草和黑麥草都在油污濃度為1%時表現(xiàn)出了最高的原油降解率，而紫花苜蓿的原油降解率隨油污濃度的升高而升高，玉米、玉米草和黑麥草屬禾本科植物，與原油降解真菌聯(lián)合接種較適合于對油污濃度在1.5%以下的土壤進行生物修復，而紫花苜蓿與原油降解真菌則對油污濃度為2%甚至以上的土壤生物修復中將會有良好的表現(xiàn)。

3 結論與討論

通過對玉米、玉米草、黑麥草和紫花苜蓿與2種原油降解真菌聯(lián)合接種試驗發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿與2種真菌聯(lián)合接種的處理具有較好的降解效果，而且隨著油污濃度的增加，降解效率越高，紫花苜蓿與真菌的聯(lián)合接種體系在油污土壤的生物修復過程中是值得應用的，并且紫花苜蓿作為一種北方常用的牧草，其根部在土壤中修復環(huán)境污染的同時，地上部分也可方便地收割處理。能夠與真菌聯(lián)合修復油污土壤的草本、禾本科植物甚至農(nóng)作物還有很多，可以預計，隨著研究范圍的不斷擴大及方法的逐漸成熟，它在環(huán)境保護、修復污染土壤方面一定會有更廣闊的應用前景。

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