兔急性房顫時(shí)心房肌鈣通道α1C、β1及鉀通道Ikr的表達(dá)和藥物干預(yù)

鄧貴智 胡建新

[摘要] 目的 通過建立兔急性房顫的模型觀察伊布利特、參松養(yǎng)心膠囊及兩藥聯(lián)合用藥對兔心房肌L型鈣離子通道α1C、β1和鉀離子通道Ikr表達(dá)的影響。 方法 通過建立兔急性房顫模型，應(yīng)用RT-PCR、Western blot檢測正常組、刺激組、伊布利特組、參松養(yǎng)心膠囊組和聯(lián)合用藥組心房肌α1C、β1 、IKr基因和蛋白表達(dá)水平，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 （1）與正常組比較，刺激組L型鈣離子通道α1C基因與蛋白表達(dá)及β1基因表達(dá)顯著降低（P<0.01）；而Ikr基因及蛋白表達(dá)無明顯變化（P>0.05 ）。（2）與刺激組比較，伊布利特組α1C基因與蛋白表達(dá)及β1基因表達(dá)高于刺激組（P <0.01），Ikr基因及蛋白表達(dá)低于刺激組（P<0.01）；參松養(yǎng)心膠囊組α1C基因與蛋白表達(dá)及β1基因表達(dá)水平與刺激組無明顯差異（P>0.05），Ikr基因及蛋白表達(dá)水平無明顯差異（P>0.05）；聯(lián)合用藥組α1C基因與蛋白表達(dá)及β1基因表達(dá)高于刺激組（P <0.01），IKr 基因及蛋白表達(dá)低于刺激組（P <0.01）。（3）與伊布利特組比較，伊布利特與參松養(yǎng)心膠囊聯(lián)合用藥組α1C基因與蛋白表達(dá)及β1基因表達(dá)水平無顯著差異（P >0.05）；Ikr基因及蛋白表達(dá)水平無顯著差異（P >0.05）；參松養(yǎng)心膠囊組α1C基因與蛋白表達(dá)及β1基因表達(dá)水平低于伊布利特組（P <0.01），Ikr基因及蛋白表達(dá)水平高于伊布利特組（P <0.01）。（4）參松養(yǎng)心膠囊組α1C基因與蛋白表達(dá)及β1基因表達(dá)水平低于聯(lián)合用藥組（P <0.01），Ikr基因及蛋白表達(dá)水平高于聯(lián)合用藥組（P <0.01）。 結(jié)論 （1）房顫誘發(fā)術(shù)后刺激組兔心房肌L型鈣離子通道α1C、β1 表達(dá)明顯下降，而IKr表達(dá)無明顯變化。（2）伊布利特可抑制L型鈣離子通道α1C、β1 表達(dá)下降及降低鉀離子通道IKr表達(dá)。參松養(yǎng)心膠囊對不能抑制L型鈣離子通道α1C、β1表達(dá)下降，對鉀離子通道Ikr的表達(dá)無明顯影響。（3）聯(lián)合用藥對比單用伊布利特對α1C、β1、IKr的表達(dá)無明顯影響。

[關(guān)鍵詞] 急性房顫；L型鈣離子通道；鉀離子通道

[中圖分類號(hào)] R965 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）05-30-05

心房顫動(dòng)（AF），簡稱房顫，是最常見的心律失常之一，全球約有3%～5%人群發(fā)生房顫。房顫的機(jī)制目前尚不明確，房顫發(fā)生時(shí)，心房肌細(xì)胞離子通道會(huì)發(fā)生一系列的改變，從而產(chǎn)生電重構(gòu)，主要表現(xiàn)為動(dòng)作電位時(shí)程（APD）、心房有效不應(yīng)期（AERP）的縮短，不應(yīng)期離散度增大、不應(yīng)期頻率適應(yīng)性下降以及傳導(dǎo)速度減慢。Bosch等[1]研究表明，房顫發(fā)生時(shí)，心肌內(nèi)有多種離子流的改變，特別是L型鈣離子流及鉀離子流的改變，兩者可能是導(dǎo)致心肌電重構(gòu)的主要原因。本實(shí)驗(yàn)研究擬探討伊布利特、參松養(yǎng)心膠囊及伊布利特與參松養(yǎng)心膠囊聯(lián)合應(yīng)用對房顫的預(yù)防作用，及其對房顫誘發(fā)實(shí)驗(yàn)中兔心肌α1C、β1、IKr表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

60只日本大耳兔隨機(jī)分正常組、刺激組[生理鹽水5 mL/（kg·d）灌胃]、伊布利特組[伊布利特（安徽豐原藥業(yè)股份有限公司，H20061029）0.1 mg/（kg·d）耳緣靜脈推注]、參松養(yǎng)心膠囊組[參松養(yǎng)心膠囊（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，Z20103032]0.2 g/（kg·d）灌胃]、伊布利特與參松養(yǎng)心膠囊聯(lián)合應(yīng)用組，簡稱聯(lián)合用藥組[耳緣靜脈推注伊布利特0.1 mg/（kg·d）及參松養(yǎng)心膠囊0.2 g/（kg·d）灌胃]。均在誘發(fā)房顫實(shí)驗(yàn)前用藥4周。除正常組外，其余各組均于用藥后4周進(jìn)行房顫誘發(fā)試驗(yàn)。

1.2 方法與步驟

1.2.1 房顫誘發(fā) 3%戊巴比妥1 mL/kg經(jīng)兔耳緣靜脈麻醉，頸部及左胸前區(qū)予NaS2脫毛備皮，行頸部氣管切開，氣管插管，動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸（呼吸頻率34～60次/min，潮氣量25～30 mL，吸/呼比3/1），同步記錄體表心電圖。胸骨正中開胸，逐層切開胸壁組織，分離出第3、4根肋骨，小心離斷（注意勿傷及肋間動(dòng)脈），剪開胸膜，暴露心臟，剪開并懸吊心包，充分暴露左心房，予自制電極一根固定于左心耳（電極頭端處可導(dǎo)電，其余處均不能導(dǎo)電），另一根電極固定于胸大肌。連接心電生理刺激儀，進(jìn)行程序期前刺激與Burst刺激相結(jié)合的方法誘發(fā)房顫，觀察心電圖，出現(xiàn)“丁”字形起搏信號(hào)表示刺激有效。多功能心電刺激儀設(shè)定：脈寬2 mv，輸出電壓為2倍舒張期閾值，S1/S2為8/1，步長-10 ms。S1S2固定于心房有效不應(yīng)期，引入第二個(gè)早搏刺激S3時(shí)加30 ms，S2S3從基礎(chǔ)周長的80%開始，以10 ms步長反掃至S3落入不應(yīng)期。以同樣的方法引入第三個(gè)早搏刺激S4直至誘發(fā)出房顫。上述方案不能誘發(fā)，則以周長為100 ms的Brust刺激進(jìn)行誘發(fā)。如均不能誘發(fā)，則房顫誘發(fā)不成功。刺激組、伊布利特組、參松養(yǎng)心膠囊組、聯(lián)合用藥組房顫誘發(fā)條件相同。

1.2.2 標(biāo)本采集 每組家兔于刺激結(jié)束后在麻醉狀態(tài)下取下心臟，用生理鹽水沖洗干凈，取少許左心耳組織放入液氮冷凍保存，以備提取組織RNA及蛋白。

1.2.3 RNA的提取與R-t PCR 取80 mg左心耳組織剪碎勻漿，采用Catrimox-Guanidinium一步法提取總RNA，提取物以40μL DEPC水溶解，采用紫外分光度儀測定溶度備用。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：RNA變性，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參照，在同一反應(yīng)體系中行PCR。L型鈣通道α1C亞基正義鏈：5-CTGGACAAGAACCAGCGACAGTGCG-3 ，反義鏈：50-ATCACGATCAGGAGGGCCACATAGGG-3。β1亞基正義鏈：5-AGCTTGCGCTGAGTTCTTGC-3，反義鏈：5-TCCCTTGCTTTGCTCTCTG-3。IKr正義鏈：5-TCGCACCATTAGCAAGATTC-3，反義鏈：5-GGATGAGCCAGTCCCACA-3。GAPDH正義鏈：5-GCTTTTAACTCTGGCAAAGTG-3，反義鏈：5-GATGATGACCCTTTTGGCTC-3。曲4μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，120 V，100 mA，30 min，溴化乙錠染色，凝膠成像儀成像，用SnyGene凝膠成像分析系統(tǒng)，根據(jù)條帶灰度和寬度自動(dòng)分析。

1.2.4 蛋白質(zhì)的提取與Western blot 取100 mg組織放入研缽剪碎研磨（在冰上進(jìn)行），加入蛋白提取液300μL、10%蛋白抑制劑30μL繼續(xù)研磨，吸取提取液冰浴放置30 min，4℃ 12 000 rpm離心10 min，吸取上清，按Bradford比色法測定蛋白濃度，加loading buffer煮沸5～10 min。聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離蛋白質(zhì)，半干式電轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂牛奶的TBST封閉液，室溫1 h，分別加α1C、Ikr單克隆抗體4℃封閉過夜，加入含有1∶2000稀釋辣根酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗工作液，室溫下孵育1 h，X光片曝光顯影，用Sicon Image軟件對Western blot條帶進(jìn)行灰度分析，按：蛋白相對含量=該蛋白條帶的灰度值/上樣對照條帶的灰度值公式計(jì)算蛋白相對含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有計(jì)量資料以（）表示，檢驗(yàn)2個(gè)或2個(gè)以上樣本率用x2檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 刺激組、伊布利特組、參松養(yǎng)心膠囊組、聯(lián)合用藥組房顫誘發(fā)情況

聯(lián)合用藥組、伊布利特組兩組房顫誘發(fā)率明顯低于刺激組（分別為x2=5.48，P=0.01；x2=4.84，P=0.02），伊布利特組與聯(lián)合用藥組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=2.12，P=0.34）。參松養(yǎng)心膠囊組與刺激組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=0.68，

2.2 α1C、β1、IKr基因表達(dá)水平

聯(lián)合用藥組、伊布利特組、參松養(yǎng)心膠囊組、刺激組L型鈣離子通道α1C、β1基因表達(dá)水平均低于正常組（t=6.47，P<0.01）。伊布利特組α1C、β1基因表達(dá)水平高于刺激組（t=5.86，P<0.01），伊布利特組α1C、β1基因表達(dá)水平高于參松養(yǎng)心膠囊組（t=8.26，P<0.01）；伊布利特組與聯(lián)合用藥組比較α1C、β1基因表達(dá)水平無明顯差異（t=1.37，P>0.05）。參松養(yǎng)心膠囊組α1C、β1基因表達(dá)水平與刺激組比較無明顯差異（t=1.61，P>0.05）。聯(lián)合用藥組α1C、β1基因表達(dá)水平高于參松養(yǎng)心膠囊組（t=3.68，P<0.05）。見表2。α1C、β1、IKr基因表達(dá)見圖3、4、6。

2.3 α1C、IKr蛋白表達(dá)水平

聯(lián)合用藥組、伊布利特組、參松養(yǎng)心膠囊組、刺激組L型鈣離子通道α1C、蛋白表達(dá)水平均低于正常組（t=3.18，P<0.05），伊布利特組α1C蛋白表達(dá)水平高于刺激組（t=6.21，P<0.01），伊布利特組α1C蛋白表達(dá)水平高于參松養(yǎng)心膠囊組（t=7.56，P<0.01）；伊布利特組與聯(lián)合用藥組比較α1C蛋白表達(dá)水平無明顯差異（t=2.01，P>0.05）。參松養(yǎng)心膠囊組α1C蛋白表達(dá)水平與刺激組比較無明顯差異（t=3.67，P>0.05）。聯(lián)合用藥組α1C、β1基因表達(dá)水平高于參松養(yǎng)心膠囊組（t=3.68，P<0.05）。見表3。α1C、IKr蛋白表達(dá)見圖5、6。

3 討論

3.1 經(jīng)房顫誘發(fā)實(shí)驗(yàn)后L型鈣離子通道α1C、β1的表達(dá)

眾多研究表明房顫可引起L型鈣離子通道α1C基因及蛋白表達(dá)下降，Ca2+內(nèi)流減少，動(dòng)作電位及有效不應(yīng)期縮短[2-3]，Bosch等[1]研究亦發(fā)現(xiàn)房顫患者中β1亞基比竇性心律者表達(dá)降低，并指出在房顫患者及動(dòng)物模型中，L型鈣離子流密度明顯下降，α1C，β1亞基及蛋白表達(dá)水平較竇性心律者降低。本研究結(jié)果表明，在兔急性房顫誘發(fā)實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)對兔心房刺激后，刺激組L型鈣離子通道α1C、β1基因及蛋白表達(dá)水平明顯低于正常組（P<0.01），提示心房經(jīng)過快速起搏時(shí)，L型鈣離子通道活性降低。心肌細(xì)胞保持細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子平衡主要通過電壓依賴方式和鈣依賴方式使鈣離子通道失活（CDI）[4]，當(dāng)心房經(jīng)過快速起搏時(shí)，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)Ca2增多，并誘發(fā)肌漿網(wǎng)釋放更多Ca2+，使細(xì)胞Ca2+內(nèi)異常升高，觸發(fā)CDI，使LVDCC活性降低，L型鈣離子通道電流密度下降，這是α1C、β1基因及蛋白表達(dá)下降的可能機(jī)制。LVDCC活性降低，Ca2+內(nèi)流減少，平臺(tái)期Ca2+降低，動(dòng)作電位時(shí)程及心房有效不應(yīng)期進(jìn)行性縮短，心房傳導(dǎo)離散度增加，不應(yīng)期頻率適應(yīng)性降低[5-6]，從而有利于房顫的發(fā)生和維持。因此，在房顫的形成過程中，α1C、β1亞基表達(dá)下降，L型鈣離子通道活性降低，動(dòng)作電位時(shí)程、心房有效不應(yīng)期縮短等都起著重要的作用。推測通過藥物干預(yù)使L型鈣離子通道活性升高，平臺(tái)期Ca2+增多，適當(dāng)延長動(dòng)作電位時(shí)程及心房有效不應(yīng)期，可以預(yù)防及減少房顫的發(fā)生，降低房顫的發(fā)生率。

3.2 經(jīng)房顫誘發(fā)實(shí)驗(yàn)后Ikr的表達(dá)

房顫時(shí)，動(dòng)作電位時(shí)程及心房有效不應(yīng)期進(jìn)行性縮短，復(fù)極加速是其重要原因。在心肌的復(fù)極過程中，有多種離子流的參與，其中延遲整流鉀通道（IK）在心肌的復(fù)極過程中起著關(guān)鍵作用。心肌細(xì)胞上的延遲整流鉀離子通道包括三種鉀電流：快激活延遲整流鉀電流（IKr）和慢激活延遲整流鉀電流（IKs），以及超快激活延遲整流鉀電流（IKu），其中以延遲整流鉀電流（IKr）最為重要[7]。IKr編碼基因是HERG，其變異可致遺傳性長QT綜合征[8-9]，EHRG表達(dá)增高，可使快激活延遲整流鉀電流增加，復(fù)極時(shí)間減少，動(dòng)作電位時(shí)程及心房有效不應(yīng)期縮短。Manios等[10]研究也表明IKr通道基因表達(dá)升高，可以使心肌細(xì)胞動(dòng)作電位2、3相外向鉀離子流增加，使心肌復(fù)極加快，動(dòng)作電位時(shí)程及有效不應(yīng)期縮短。但Yue等[11]在對犬房顫誘發(fā)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)快速起搏的犬心房及已成功誘發(fā)房顫的犬心房中，IKr表達(dá)與對照組比較并無差異。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在經(jīng)快速起搏的兔心房中，刺激組Ikr通道基因及蛋白表達(dá)水平與正常組比較無明顯差異，與Yue等實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。因此，本研究認(rèn)為在房顫的發(fā)生過程中，心房快心率時(shí)IKr通道基因及蛋白不會(huì)升高，IKr可能沒有參與心房的電重構(gòu)，房顫發(fā)生時(shí)，APD及ERP縮短可能由L型鈣通道及其他離子通道功能失調(diào)所致。IKr通道基因表達(dá)異常升高，可以使細(xì)胞動(dòng)作電位2、3相外向鉀離子流增加，復(fù)極加快，動(dòng)作電位時(shí)程及有效不應(yīng)期縮短，可能有利于房顫的發(fā)生及維持，Li等[12]研究發(fā)現(xiàn)犬左房HERG蛋白表達(dá)高于右房，同時(shí)觀察到犬左房動(dòng)作電位時(shí)程及心房有效不應(yīng)期短于右房，考慮左心房IKr通道基因高表達(dá)是左心房好發(fā)房顫的因素之一，但在房顫發(fā)生的過程中，IKr基因及蛋白表達(dá)并無明顯變化。因此，可以推測應(yīng)用藥物干預(yù)使心房IKr通道基因表達(dá)適當(dāng)下降，可以減少房顫的發(fā)生。Lai等[13]發(fā)現(xiàn)，在慢性房顫患者中，IKr通道基因表達(dá)水平低于竇性心律者，其表達(dá)水平降低可能是對長期房顫時(shí)縮短的動(dòng)作電位時(shí)程及心房有效不應(yīng)期的一個(gè)自身的反饋調(diào)節(jié)，從而減輕房顫后心房的電重構(gòu)，是一種保護(hù)機(jī)制。

3.3 經(jīng)房顫誘發(fā)實(shí)驗(yàn)后伊布利特、參松養(yǎng)心膠囊干預(yù)的效果

本實(shí)驗(yàn)表明伊布利特可以抑制兔心房快速起搏時(shí)L型鈣離子通道α1C、β1表達(dá)的下降。α1C、β1是LVDCC主要功能亞基，α1C、β1表達(dá)的降低，可使L型鈣通道活性降低，L型鈣電流（ICa-L）密度下降，Ca2+內(nèi)流減少，心肌細(xì)胞動(dòng)作2相平臺(tái)期縮短，APD及ERP縮短，ERP頻率適應(yīng)性降低，有利于折返的形成，使房顫得以發(fā)生及維持。伊布利特能夠抑制α1C、β1表達(dá)下降，促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，有效延長APD及ERP，從而不利于心律失常的發(fā)生，可能是其具有預(yù)防兔急性房顫發(fā)生作用的機(jī)制之一。本研究實(shí)驗(yàn)表明，伊布利特可以降低鉀離子通道IKr基因及蛋白的表達(dá)。IKr是細(xì)胞復(fù)極的主要離子流，與Na+和Ca2+內(nèi)流的相對速率決定平臺(tái)期的長短。IKr通道基因的高表達(dá)，可以使心肌細(xì)胞復(fù)極時(shí)外向鉀離子流增加，使復(fù)極加快，APD及ERP縮短。伊布利特可以降低IKr通道基因的表達(dá)，使復(fù)極時(shí)外向鉀離子流減少，可以使復(fù)極時(shí)間延長APD及ERP，從而不利于房顫的發(fā)生及維持。因此，心臟瓣膜術(shù)后等房顫高發(fā)人群中，應(yīng)用伊布利特可能能起到很好的預(yù)防作用。伊布利特其副作用可過度延長有效不應(yīng)期及QT間期，部分患者可致尖端扭轉(zhuǎn)型室速（Tpd）[14-15]，有報(bào)道伊布利特致Tpd發(fā)生率為4.3%，可能與其使鈣離子內(nèi)流增多，過度阻滯IKr，易誘發(fā)早期后除極有關(guān)。

該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)參松養(yǎng)心膠囊組兔急性房顫誘發(fā)率41.7%明顯低于刺激組75.0%，但可能由于樣本數(shù)量偏少，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其對房顫的發(fā)生可能有一定的影響，有待于進(jìn)一步的研究。本研究發(fā)現(xiàn)參松養(yǎng)心膠囊組α1C、β1的表達(dá)與刺激無明顯差異（P>0.05），但低于正常組（P<0.01）。提示參松養(yǎng)心膠囊不能抑制心房快速起搏時(shí)α1C、β1表達(dá)的下降，也不能使心房快速起搏時(shí)已表達(dá)下降的α1C、β1表達(dá)進(jìn)一步下降。因?yàn)樵谛姆靠焖倨鸩珪r(shí)，L型鈣離子通道活性下降，α1C、β1的表達(dá)已有降低，所以尚不能提示其對鈣離子通道是否有阻滯作用。伊布利特與參松養(yǎng)心膠囊聯(lián)合用藥組與伊布利特組無明顯差異（P>0.05），提示參松養(yǎng)心膠囊不能協(xié)同伊布利特抑制α1C、β1表達(dá)的下降，也不能使伊布利特抑制α1C、β1表達(dá)的下降作用降低。李寧等[16]研究發(fā)現(xiàn)參松養(yǎng)心膠囊提取干粉對正常心肌細(xì)胞INa、ICa-L有阻滯作用，因此可以推測，參松養(yǎng)心膠囊對正常的L型鈣離子通道可能具有阻滯作用，但對房顫發(fā)生時(shí)活性已降低的L型鈣離子通道影響有限。

本實(shí)驗(yàn)表明參松養(yǎng)心膠囊組IKr表達(dá)與正常組、刺激組無明差異（P>0.05），提示參松養(yǎng)心膠囊對兔心房肌IKr表達(dá)沒有影響。聯(lián)合用藥組IKr表達(dá)與伊布利特組無明顯差異，提示參松養(yǎng)心膠囊不能影響伊布利特對IKr的阻滯作用。

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（收稿日期：2013-01-31）