HPLC法測定羌活中紫花前胡苷的含量

黃育生　袁賢琳　鐘瑜　王汝俊

【摘要】目的：建立HPLC法測定羌活中紫花前胡苷含量的方法。方法：HPLC條件：色譜柱為Agilent Hc-C18柱（5μm，4.6×250mm），流動相為甲醇-水（32：68），流速為1.0ml·min^-1，檢測波長為335nm，柱溫為35℃。結(jié)果紫花前胡苷范圍為4.00μml^-1-100μm·ml^-1，平均回收率為99.90%，RSD為1.50%。結(jié)論：該法操作簡單，重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為羌活中紫花前胡苷的含量測定方法提供參考依據(jù)。

【中圖分類號】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1007-8517（2013）10-0014-02

羌活為傘形科植物羌活Notopterygium incisum Tinz exH.T.Chang或?qū)捜~羌活Notopterygium franchetii H.deBoiss，的干燥根莖和根。本品具有解表散寒，祛風(fēng)除濕，止痛的功效，常用于治療風(fēng)寒感冒，頭痛項(xiàng)強(qiáng)，風(fēng)濕痹痛，肩背酸痛。其主要成分有香豆素類成分（如紫花前胡苷、羌活醇及異歐前胡素等）、揮發(fā)油、阿魏酸等。有研究表明紫花前胡苷是羌活的有效成分，具有鎮(zhèn)痛、抗炎作用。但是2010年版藥典第一部只收載了羌活醇和異歐前胡素總量的含量測定方法，且目前對于HPLC法測定羌活中的紫花前胡苷含量的報(bào)道很少。本文研究建立了HPLC法測定羌活中的紫花前胡苷含量，為羌活的質(zhì)量控制及復(fù)方制劑中羌活的有效成分轉(zhuǎn)移率提供新的參考依據(jù)。結(jié)果表明本方法操作簡單，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好。

1、儀器與試藥

高效液相色譜儀：SPD-20A紫外檢測器，LC-20AT泵（日本島津公司）；Saxtorious BT 25S電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；KQ-100DE型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

羌活中藥飲片（批號20100702，佛山市中藥飲片廠有限公司）；紫花前胡苷對照品（批號111821-201102，中國食品藥品檢定研究所）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。2色譜條件與系統(tǒng)適用性

Agilent HC-C18色譜柱（5μm，4.6×250mm）；流動相：甲醇一水（32：68）；流速：Iml·min^-1；柱溫：35%；檢測波長：335nm。紫花前胡苷峰與前后峰的分離度均在1.5以上，理論板數(shù)按紫花前胡苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

3、實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

3.1 對照品溶液的制備 精密稱取紫花前胡苷對照品，加甲醇制成每lml含40μg的溶液，即得。

3.2 供試品溶液的制備 取藥材粉末（過三號篩）約0.5g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，稱定重量，超聲30min。放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25ml，置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)盟s20ml使溶解，并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和正丁醇萃取4次，每次20ml，合并正丁醇液，水浴蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25ml量瓶中，稀釋定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。3.3測定法分別精密吸取對照品溶液51xl和供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，見圖1。3.4線性關(guān)系考察精密稱取紫花前胡苷對照品5.00mg置于25ml的量瓶，用甲醇稀釋至刻度，即得濃度為O.20rag·ml^-1的對照品溶液貯備液，分別精密量取上述貯備液0.2、0.5、1、2、3、4、5ml，置于10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得濃度為4.00、10.00、20.00、40.00、60.00、80.00、100.00μg·ml^-1的梯度對照品溶液，精密量取上述梯度對照品溶液各5μl，按上述色譜條件測定，以對照品峰面積Y為縱坐標(biāo)，對照品溶液（μg/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：紫花前胡苷濃度在4.00μg·ml^-1～100.00μg·ml^-1范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為：Y=270.85+1.3598×104X.r=0.9999。

3.5 精密度試驗(yàn)精密吸取同一對照品溶液5μl連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算紫花前胡素峰面積的RSD（n=6）為0.4%，表明儀器精密度良好。

3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材，按供試品溶液制備方法平行制備6組供試品溶液，按上述色譜條件測定，結(jié)果樣品中紫花前胡苷的平均含量（n=6）為0.266%，RSD為2.9%。3.7穩(wěn)定性考察取同一個(gè)供試品溶液，分別于O、2、4、6、8、10、12h進(jìn)樣，按上述色譜條件測定，結(jié)果紫花前胡苷峰面積的RSD（n：7）為O.3%，表明供試品溶液在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取“3.6”項(xiàng)下已知紫花前胡苷含量的羌活藥材粉末（過三號篩）約O.25g，分取6份，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入濃度為O.0133mg·ml^-1的對照液50ml（精密稱取紫花前胡苷對照品6.65mg，置于500ml量瓶，用50%甲醇稀釋至刻度，即得濃度為0.0133rag·ml^-1的對照液），稱定重量，超聲30min。放冷，再稱定重量，用濃度為0.0133mg/ml的對照液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，按“3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率（n=6）為99.64%，RSD為1.22%。見表1。

3.9 樣品測定 取產(chǎn)地為四川的羌活藥材，共5批，按“3.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，結(jié)果見表2。

4、討論

4.1 樣品萃取純化試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，只對羌活進(jìn)行超聲處理，供試品中雜質(zhì)較多，而用水飽和正丁醇萃取之后與前者比較，雜質(zhì)大大減少，并且紫花前胡苷的含量無明顯差異，故從保護(hù)色譜系統(tǒng)，減少雜質(zhì)干擾方面考慮，選擇用水飽和正丁醇處理純化供試品溶液。試驗(yàn)比較結(jié)果亦表明萃取四次后，第五次的萃取液幾乎不含紫花前胡苷。

4.2 樣品提取方法的選擇試驗(yàn)中對加熱回流提取1h和超聲處理30min的樣品中的紫花前胡苷提取效果進(jìn)行對比，結(jié)果表明兩種方法對紫花前胡苷的提取效果無明顯差異，但超聲處理方法簡便快捷，故選擇超聲處理30min。

4.3 提取溶劑的選擇 試驗(yàn)中對比了甲醇和50%甲醇對紫花前胡苷提取效果的影響，結(jié)果表明，兩者對紫花前胡苷的提取效果無明顯差異，故從成本及環(huán)保等方面考慮，選擇50%甲醇為提取溶劑。

4.4 超聲時(shí)間的選擇 試驗(yàn)中對比了20、30、40min三個(gè)超聲時(shí)間對紫花前胡苷提取效果的影響，結(jié)果表明30min和40min的提取效果無明顯差異，而比20min的提取效果略高，故選擇超聲處理30min。

4.5 吸收波長與流動相比例選擇 取紫花前胡苷對照品的甲醇溶液，在紫外分光光度計(jì)190～400nm波長掃描。結(jié)果在335nm波長處有最大吸收，故選擇335nm為本品的測定波長，見圖2。

流動相甲醇一水的比例調(diào)節(jié)為32：68時(shí)，紫花前胡苷峰與前后峰的分離度均大于1.5。

4.6 孫玉茹等的研究，流動相為甲醇-水-乙腈（6：71：21）測定羌活中紫花前胡苷含量，紫花前胡苷的保留時(shí)間較小，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，供試品雜質(zhì)較多，較小保留時(shí)間可能會有峰的重疊，分離度不符合要求。朱美曉等的研究，以乙腈-水（15：85）為流動相，使用不同色譜柱Phenome-nex Synergi 4μ Hydro-RP C18，Phenomenex Luna C18和Agi-lent Extend-C18測定羌活中紫花前胡苷含量，只有Phe—nomenex Synergi 4μ Hydro-RP C18能達(dá)到最佳分離效果，而其他色譜柱都不能有效分離。而本試驗(yàn)使用Agilent HC-C18色譜柱（5μm，4.6×250mm），以甲醇-水（32：68）亦能達(dá)到有效分離。

某些中藥亦含有紫花前胡苷，如紫花前胡、前胡等，并有HPLC法紫花前胡苷含量測定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)參考上述相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)的方法，考察各個(gè)因素對紫花前胡苷提取效果及HPLC色譜分離效果的影響，最終優(yōu)化建立了HPLC法測定羌活中紫花前胡苷含量的方法，該法操作簡單，重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為羌活中紫花前胡苷的含量測定方法提供參考依據(jù)。尤其是中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，使用水飽和正丁醇萃取可有效地純化紫花前胡苷，減少雜質(zhì)，這對含羌活的復(fù)方制劑的質(zhì)量控制有重大的參考意義。