卵巢上皮癌細胞株OVCAR—3培養(yǎng)相關影響因素分析

洪瀾 朱根海 王圣坦 蔡俊宏

[摘要]目的 探討卵巢上皮癌細胞OVCAR-3培養(yǎng)的影響因素，提高培養(yǎng)的成功率。 方法 按培養(yǎng)條件分為：未濾菌加抗菌素組、濾菌加抗菌素組、濾菌不加抗菌素組及改良復蘇組，取對數(shù)生長期的細胞裸鼠皮下種植，觀察成瘤率并行組織學檢查。 結果 未濾菌加抗菌素組，復蘇培養(yǎng)5次，全部失?。粸V菌加抗菌素組，復蘇培養(yǎng)10次，全部成功；濾菌不加抗菌素組，復蘇培養(yǎng)10次，失敗4次，成功率60%；改良復蘇組：復蘇培養(yǎng)10次，全部成功。種植后2周出現(xiàn)瘤體，各組成瘤率100%，各組腫瘤組織學檢查未見明顯差異。 結論 無菌操作是OVCAR-3最重要的影響因素，濾菌及加用抗菌素是關鍵步驟。

[關鍵詞] 細胞培養(yǎng)；卵巢上皮癌細胞株

[中圖分類號] R737.31 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）05-28-03

卵巢上皮癌細胞培養(yǎng)是卵巢癌臨床與基礎研究的基本技術，其成功與否直接影響到卵巢癌研究的進程和質量。卵巢上皮癌細胞株種類較多，OVCAR-3是近年來使用比較多的卵巢上皮癌細胞株[1]，本研究通過對其培養(yǎng)成功和失敗的總結，分析其影響因素，以期達到提高培養(yǎng)成功率的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株和實驗試劑 人卵巢上皮癌OVCAR3細胞株（American type culture Collection，ATCC）（Manassas， VA），胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)液（Invitrogen，CA）。胰酶、二甲基亞砜（DMSO），青霉素和鏈霉素溶液。

1.1.2 實驗儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（BB16UV，德國Heraeus公司），超凈工作臺（VS-1300L型，蘇州安泰空氣技術有限責任公司），倒置相差光學顯微鏡（IX71型，Olympus），恒溫水浴鍋（DZW-4型，金壇市恒豐儀器廠）。

1.1.3 雌性BALB/c裸鼠購自廣東省實驗動物中心；鼠齡4～6周，體重15 ～ 17 g；SPF（special pathogen free）級屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)，飼料及鋪墊物均經(jīng)過滅菌處理，所有進入實驗室的人及各種用品均經(jīng)過嚴格的微生物控制。

1.2 方法

1.2.1 在不同的條件下進行培養(yǎng) （1）未濾菌加抗菌素組：所有試劑均未使用濾菌膜過濾，每10毫升培養(yǎng)液中加入20 μL濃度為200 U/mL的青霉素和鏈霉素溶液， 共復蘇培養(yǎng)5次。（2）濾菌加抗菌素組：胎牛血清及培養(yǎng)液使用0.22μm及0.45μm濾菌膜過濾[2]，并加入20μL濃度為200 U/mL的抗菌素液，共復蘇培養(yǎng)10次。（3）濾菌不加抗菌素組：胎牛血清使用0.22μm及0.45μm濾菌膜過濾，不加抗菌素液，共復蘇培養(yǎng)10次。（4）改良復蘇組：以上各組均采用傳統(tǒng)方法復蘇[3]，細胞復蘇后加入10 mL培養(yǎng)液洗滌低速離心，棄上清液再加入培養(yǎng)液培養(yǎng)，本組指細胞復蘇后直接加入培養(yǎng)液10 mL進行培養(yǎng)，第2天換液，共復蘇培養(yǎng)10次。

1.2.2 具體方法 按以上方法復蘇后隔兩天換含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，每次換液保留1/3原培養(yǎng)液，待細胞基本鋪滿瓶底80%左右進行傳代，吸凈培養(yǎng)液加入0.25%的胰酶溶液2 mL消化2 min使之脫壁游離，加入不含胎牛血清的培養(yǎng)液7 mL洗滌并低速離心，棄上清液，重復兩次，再加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液6 mL吹打成細胞懸液，按1∶3的傳代方式分置3個培養(yǎng)皿，每個補足培養(yǎng)液至10 mL，于37℃、5%CO2的條件下進行傳代培養(yǎng)。細胞凍存方法： 配置凍存液，95%的原細胞生長用的新鮮培養(yǎng)液及5%的DMSO，細胞經(jīng)胰酶消化、低速離心并棄上清液后用合適量的凍存液吹打成細胞懸液，細胞濃度為5×106/mL，按每份0.5 mL分裝于冷凍管中，標記封口后先放入4℃冰箱10 min，轉入-20℃放置30 min，再移置-80℃冰箱16～18 h或過夜，最后取出放入液氮罐中貯存。

1.2.3 皮下種植及腫瘤組織學檢查[4] 取對數(shù)生長期的OVCAR-3 細胞以0.25%的胰酶消化后， 加入不含胎牛血清培養(yǎng)液制成細胞懸液，離心后重懸于PBS 溶液中，制備2×106 /0.1 mL細胞懸液，0.2 mL/只接種至裸小鼠的頸背部近腋窩處皮下，取瘤體行病理活檢（HE染色），以上各組培養(yǎng)成功后各皮下種植5只。

2 結果

（1）未濾菌加抗菌素組：復蘇培養(yǎng)5次，全部失敗。（2）濾菌加抗菌素組：復蘇培養(yǎng)10次，全部成功。（3）濾菌不加抗菌素組：復蘇培養(yǎng)10次，失敗4次。（4）改良復蘇組：復蘇培養(yǎng)10次，全部成功。

種植后2周出現(xiàn)瘤體，各組成瘤率100%，2個月解剖取瘤組織活檢示腫瘤細胞形狀大小不一，體積增大，核大深染，核分裂較多，各組腫瘤組織學檢查未見明顯差異。見圖1～2。

3 討論

腫瘤細胞培養(yǎng)受很多因素影響，包括細胞株的選擇、凍存條件、化學藥品的殘留、物理損傷及各種污染控制等[5]，其中最重要的是污染控制，還要考慮的是細胞培養(yǎng)基外加成分如抗菌素等對細胞特性是否有影響。

3.1 培養(yǎng)液是否需要濾菌器除菌

濾過的主要目的是清除雜質及病原體，培養(yǎng)液配制過程都是無菌條件下進行，也沒有雜質，生產(chǎn)過程中已經(jīng)反復濾菌處理，理論上不需進一步過濾，但配制過程涉及很多環(huán)節(jié)，很難保證某些環(huán)節(jié)不受污染，本次實驗結果也證實，培養(yǎng)液未經(jīng)濾菌器處理的細胞培養(yǎng)均失敗。一般采用0.45μm 及0.22μm濾菌器雙層過濾。最終配制好的培養(yǎng)液包括胎牛血清均需過濾，過濾后分裝凍存?zhèn)溆谩：芏嗍褂谜哒J為過濾繁瑣，且說明書上并未注明必須過濾除菌，導致培養(yǎng)失敗，因此濾菌器除菌是細胞培養(yǎng)非常重要的環(huán)節(jié)。

3.2 細胞復蘇后是否需要洗滌細胞

傳統(tǒng)方法細胞復蘇后需要多次低速離心洗滌細胞以去除DMSO，但很多研究者認為DMSO在加入培養(yǎng)液稀釋后濃度較低，對細胞造成的影響很小，況且離心可能會增加污染的機會并對對剛復蘇的細胞造成一定的損傷，所以建議省略洗滌細胞這一步[6-7]。本組研究結果提示兩種方法都可以，改良的方法更簡單，操作更方便，改良培養(yǎng)法應該在第2天細胞貼壁后換培養(yǎng)液以清除殘存的DMSO。

3.3 細胞培養(yǎng)液是否要加抗菌素或其他助生長劑

上皮細胞培養(yǎng)受諸多條件限制[8]，一般要加抗菌素或其他試劑促細胞生長[9]，腫瘤細胞抵抗力較強，生長很快，有研究者認為可以不加包括抗菌素在內(nèi)的其他附加藥物，該細胞株的出品地ATCC的培養(yǎng)說明中也沒有建議加抗菌素，但不是每個實驗室的條件都能控制到理想狀態(tài)，細胞培養(yǎng)時不可避免受到各種病原體的污染[10]，本研究結果亦提示不加抗菌素培養(yǎng)失敗率較高，或者細胞生長緩慢，因此加抗菌素有利于細胞培養(yǎng)。還有些作者認為加用層粘連蛋白 α2有利于腫瘤細胞的生長[11]，對于卵巢癌細胞株是否需要加入助生長劑目前尚未見報道，本研究認為只要沒有病原體污染，細胞生長完全能滿足研究的需要，不需加助生長劑。雖然卵巢上皮癌細胞比較容易培養(yǎng)，但仍需一定的技術條件[12]，其中就包括抗菌素的應用，使用的抗菌素為青霉素和鏈霉素混合溶液，使用濃度為200 U/mL，抗菌素的使用有兩種方法，一種是和培養(yǎng)液配制時一起加入，分裝備用，另一種是在培養(yǎng)時把抗菌素直接加入至培養(yǎng)皿中，因抗菌素在培養(yǎng)液中保存時間長可能會失效，所以目前多采用在培養(yǎng)皿中直接加入。

3.4 不同的培養(yǎng)條件對細胞特性是否有影響

本組研究還提示無論是傳統(tǒng)的復蘇方法還是改良的復蘇方法，或是否加用抗菌素，只要細胞能正常傳代，其接種裸鼠后成瘤率及細胞特性都沒有變化，因此改良的復蘇方法及加用抗菌素對細胞特性沒有影響，可以作為腫瘤細胞的培養(yǎng)常規(guī)。

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（收稿日期：2013-01-14）