FAK的基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)系

王麗

[摘要] 目的 探討粘著斑激酶的基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)系。 方法 目前已知的FAK兩個cSNP位點分別是C2564T和G3104T，它們編碼的蛋白質(zhì)分別由Pro，Gly轉(zhuǎn)變成Ser，Cys。本研究采用基因多態(tài)性檢測方法（PCR+RFLP）檢測冠脈造影確診的冠心病患者215例（男109例，女106例）及與其年齡，性別及體重指數(shù)相匹配的健康體檢者168例（男86例，女82例）FAK的一個cSNP位點C2564T的基因型，探討FAK的C2564T基因型與冠心病的關(guān)系。 結(jié)果 男性冠心病患者中FAK的C2564T基因型等位基因T和C與男性健康體檢者中等位基因T和C比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。女性冠心病患者與女性健康體檢者兩組比較亦差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 FAK的C2564T基因型可能與冠心病的發(fā)生有一定的關(guān)系。

[關(guān)鍵詞] 粘著斑激酶；基因多態(tài)性；冠狀動脈疾病

[中圖分類號] R541.4 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）05-22-03

粘著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）是Schaller等1992年發(fā)現(xiàn)的能使Src內(nèi)源性蛋白酪氨酸激酶激活的主要底物，屬于非受體蛋白酪氨酸激酶，它是整合素介導(dǎo)的平滑肌細胞遷移途徑中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵[1]。眾所周知，血管平滑肌細胞（VSMC）的遷移和增殖在動脈粥樣硬化斑塊形成及血管成形術(shù)后再狹窄的發(fā)生過程中起著重要的作用。冠心病作為一種多基因疾病已成為疾病基因組學(xué)研究的重點。目前已知的FAK兩個cSNP位點分別是C2564T和G3104T，它們編碼的蛋白質(zhì)分別由Pro，Gly轉(zhuǎn)變成Ser，Cys[2]。因此本研究采用病例-對照設(shè)計及基因多態(tài)性檢測（PCR+RFLP）的方法，檢測FAKC2564T的基因型，旨在探討其基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2011年5～10月在本院心血管內(nèi)科就診的冠狀動脈造影陽性的冠心病患者共215例（冠心病組），男109例，女106例，年齡50～77歲，平均（61.9±10.6）歲。從同期健康體檢者中選取年齡，體重指數(shù)（BMI）與患者相匹配的志愿者（對照組）168例，男86例，女82例，年齡50～78歲，平均（63.3±6.3）歲，均無急慢性肝病、高血壓、冠心病、糖尿病、肥胖等疾病。

1.2 方法

1.2.1 DNA抽取 空腹12 h后，取肘靜脈血1 mL EDTA抗凝，用DNA抽取試劑盒從150μL靜脈血中提取DNA。

1.2.2 PCR擴增 10μL PCR反應(yīng)體系含：基因組DNA 0.5 μg，上游和下游引物分別為20 pmol，dNTPs 0.25 mmol，Taq酶0.5μL，10Buffer緩沖液1μL，Mgcl2 2 mmol，去離子水補足10μL。引物序列分別為：上游引物：5AGCCCACAGCACATGGTACA3下游引物：5GCCAAGCCGACTTCCTTCA3（序列由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成）。擴增條件：95℃預(yù)變性5 min后，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，循環(huán)32次，最后72℃延伸5 min。

1.2.3 限制性內(nèi)切酶消化 PCR產(chǎn)物10μL，BglII 5 U，10Buffer 2μL，37℃消化5 h。

1.2.4 電泳 2%瓊脂糖凝膠電泳，以100 bp的marker作為DNA片斷大小的標準物，于100 V恒流下電泳15 min，0.5μg/mL溴化乙淀（EB）顯色鑒定。

1.2.5 分析 FAK PCR產(chǎn)物片斷總長度經(jīng)特異性限制內(nèi)切酶切割后，可出現(xiàn)三種片斷大小的組合。等位基因頻率計算：采用平衡法，C=CC+1/2CT；T=TT+1/2CT。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)均以（）表示，進行x2檢驗分析。

2 結(jié)果

2.1 FAK基因的PCR產(chǎn)物酶切電泳圖

PCR擴增產(chǎn)物為363 bp，取3個樣本測序確認，其余經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳確認后，取PCR產(chǎn)物10μL，10 Buffer 2μL，加限制性內(nèi)切酶BglII 5 U于37℃消化5 h。在紫外燈下觀察結(jié)果為：純合子（TT）電泳圖譜為363 bp一條帶，純合子（CC）電泳圖譜為130 bp和233 bp兩條帶，雜合子（TC）電泳圖譜為363 bp、130 bp和233 bp三條帶。見圖1。

1.DNA marker；2.純合子（TT） 電泳圖譜；

3.雜合子（TC）電泳圖譜；4.純合子（CC）電泳圖譜

圖1 FAK基因的PCR產(chǎn)物酶切電泳圖

2.2 冠心病組和對照組的FAK C2564T基因型和等位基因頻率分布

男性冠心病患者中FAK基因C2564T基因型等位基因T和C的頻率分別為69.25%、30.75%；男性健康體檢者等位基因T和C的頻率分別為40.7%、59.3%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

女性冠心病患者中FAK基因C2564T基因型等位基因T和C的頻率分別為73.6%、26.4%；女性健康體檢者等位基因T和C的頻率分別為44.5%、55.5%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

3 討論

冠狀動脈粥樣硬化發(fā)生過程中一個重要環(huán)節(jié)是VSMC在多種細胞因子的刺激下遷移粘附和增殖，其分子基礎(chǔ)是細胞與細胞外基質(zhì)（ECM）之間的相互作用。在正常血管壁中，VSMC通過與ECM相互作用保持其自身分化狀態(tài)；在動脈粥樣硬化、血管再狹窄發(fā)生過程中，可通過ECM的降解，合成及重新編排使VSMC發(fā)生重構(gòu)。VSMC與ECM之間的相互作用是由ECM受體蛋白—整合素介導(dǎo)的，而FAK是整合素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵，在ECM誘導(dǎo)的VSMC粘附遷移，增殖過程中發(fā)揮重要作用[3]。

單核苷酸多態(tài)性（SNP）為數(shù)眾多，分布廣泛，位于編碼區(qū)SNP（cSNP）可引起蛋白質(zhì)重要部位氨基酸變異，導(dǎo)致其功能改變，是基因組中決定人類表型多樣性的核心信息。本研究結(jié)果顯示，男性冠心病患者中FAK等位基因T和C與男性健康體檢者中等位基因T和C比較有顯著性差異（P<0.05）。女性冠心病患者與女性健康體檢者兩組比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

FAK是Schaller等1992年發(fā)現(xiàn)的能使Src內(nèi)源性蛋白酪氨酸激酶激活的主要底物，是構(gòu)成粘著斑的主要成分之一。FAK有6個磷酸化位點，Tyr397是自身磷酸化位點，可與Src相互作用，使體外FAK激酶的活性達到最大[4]。FAK是細胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交匯點，通過影響細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對血管平滑肌細胞的遷移和增殖有一定的調(diào)控作用[5]。血管損傷后，中膜的VSMC向內(nèi)膜遷移，F(xiàn)AK可通過激活多個下游信號，如Src家族，PTKs，PI3K，或與其他信號蛋白如GRB2結(jié)合，從而促進VSMC遷移[6]。2000年Christof等[7]發(fā)現(xiàn)FAK可以促使PDGF-BB激活ERK2，這是使VSMC發(fā)生趨化性遷移所必需的。Daniel等[8]在2003年發(fā)現(xiàn)的人類巨細胞病毒趨化因子受體U28誘導(dǎo)的VSMC遷移也是FAK介導(dǎo)的，但具體機制不詳。同時Zhongbiao等[9-10]也提出了FAK在IL-6引起的肌動蛋白細胞骨架重排使VSMC遷移的過程中發(fā)揮了重要作用。VSMC是呈錨著依賴性生長的細胞，它的增殖在血管狹窄和再狹窄的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，它的增殖需要生長因子和ECM的共同刺激，而FAK同時參與二者介導(dǎo)的通路[11-12]。

本研究顯示FAK的C2564T不同基因型可能與冠心病的發(fā)生有一定關(guān)系，但具體作用機制尚不清楚，有待進一步深入研究，從而為冠心病防治提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2013-01-07）