肉雞大腸桿菌病病原的分離鑒定

孫艷紅

引言

雞大腸桿菌病是指由禽致病性大腸桿菌所引起的局部或全身感染的疾病，大腸桿菌病在哺乳動物主要引起腸道疾病，而在禽類當宿主受到致病性大腸桿菌感染而其防御能力不足以抵抗或完全喪失時，常會引起典型的繼發(fā)性局部或全身性感染。此病可引起雞的胚胎死亡、臍炎、敗血癥等一系列病癥。由于大腸桿菌抗原復雜、血清型眾多且易形成耐藥性，給該病的預防造成很大困難。隨著我國養(yǎng)雞業(yè)集約化的迅速提高，雞大腸桿菌病的流行勢頭也愈加猛烈。繼發(fā)感染其他疾病或混合感染，使本病的發(fā)病率和死亡率明顯升高，以及大量的藥物、疫苗和人工費用等的支出，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失。本文對河北省永清縣肉雞致病性大腸桿菌進行了分離、鑒定、藥敏試驗及動物實驗等，以為最終成功預防控制該病提供參考。

1、實驗材料與方法

病料：無菌采取發(fā)病肉雞的心臟、肝臟、肺等臟器。

培養(yǎng)基及生化試劑：普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基，伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇、肌醇等細菌生化微量鑒定管，VP試劑甲液、乙液。

抗菌藥物：阿莫西林、頭孢噻肟、新霉素、強力霉素、替米考星、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、黏菌素、氟苯尼考、紅霉素、四環(huán)素、痢菌凈、泰妙菌素、林可霉素、頭孢克肟、泰樂菌素；硫酸慶大霉素注射液。

藥敏片：嚴格按照主要文獻參考書中制備。

實驗動物 ：昆明系小白鼠30只。雛雞30只14日齡非免疫健康雛雞，用于動物實驗。

分離與培養(yǎng)：無菌鉤取病料分別劃線培養(yǎng)于營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板，37℃有氧培養(yǎng)24h。分離得到5株細菌分離株分別進行編號。

細菌純化：鑒別培養(yǎng)后，分別挑取每個分離株的單個菌落接種于麥康凱培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18h，挑取單個菌落，經(jīng)涂片染色，鏡檢，證實為純培養(yǎng)物后，將純培養(yǎng)物置4℃冰箱中備用。

生化試驗：按常規(guī)方法對5株細菌分離物分別進行葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇、肌醇等糖發(fā)酵試驗，VP試驗，尿素、賴氨酸、水楊酸、枸櫞酸鹽利用試驗，硫化氫試驗。

溶血試驗：參照文獻描述方法進行。

藥敏試驗：采用紙片擴散法結(jié)果按抑菌圈直徑大小作為判定敏感性的標準，20mm以上判為極敏；15～20mm判為高敏；10～14mm判為低敏；10mm以下判為耐藥判定。

動物試驗：制取5株細菌分離物，每個分離株都取細菌懸液原液稀釋備用。

將30只小白鼠和30只雛雞隨機平均分為6組并分別進行編號，每組5只分別腹腔接種菌液，0.5mL/只。留取一組小白鼠和一組雛雞腹腔接種相同劑量滅菌生理鹽水做陰性對照。6組小鼠和雛雞分別進行隔離飼養(yǎng)7d。接種后每天觀察記錄小鼠、雛雞的精神、食欲、飲水、糞便、運動及死亡情況，死亡小鼠及雛雞及時進行病理剖檢及回歸試驗。

2、結(jié)果

細菌分離、生化試驗結(jié)果 、溶血試驗結(jié)果、溶血試驗結(jié)果：從病料中共分離到5株細菌分離物，經(jīng)培養(yǎng)特性觀察、染色鏡檢、生化試驗結(jié)果5株分離株符合大腸桿菌的特征，5株細菌分離物均為β-溶血。

藥敏試驗結(jié)果：5株分離菌對阿莫西林、紅霉素、林可霉素和泰樂菌素的耐藥性最高，余下依次為四環(huán)素、氟苯尼考、頭孢噻肟、替米考星、環(huán)丙沙星、痢菌凈、泰妙菌素、頭孢克肟、強力霉素、阿奇霉素、慶大霉素、新霉素、黏菌素。分離菌表現(xiàn)出多重耐藥性。

動物試驗結(jié)果：細菌計數(shù)成功后用于動物實驗。

人工接種小鼠實驗：分別把小白鼠、雛雞分六組，五組小白鼠和雛雞進行接種留取一組，之后小白鼠和雛雞分別在12h和24h出現(xiàn)大腸桿菌典型病癥，無菌采取死亡小白鼠、雛雞脾臟、肝臟等器官，劃線接種普通瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h，分離到與接種菌相同生物學特性的革蘭氏陰性桿菌。結(jié)果表明5株大腸桿菌分離物對小鼠和雛雞都具有高致病性。留取一組未接種的小白鼠和雛雞整個實驗觀察期內(nèi)均表現(xiàn)正常。

3、結(jié)論

本試驗中，從病雞病料分離到5株細菌分離物，根據(jù)培養(yǎng)特性觀察、染色鏡檢、溶血試驗和生化試驗結(jié)果可將該菌株判定為大腸桿菌。送檢的病雞剖檢病變特征有心包膜混濁，增厚，心包膜及心外膜上有纖維蛋白附著，白色；肝臟表面有一層白色纖維蛋白附著；氣囊混濁，內(nèi)有黏稠的黃色干酪樣分泌物；肺部淤血水腫；腹腔臟器的表面覆蓋一層淡黃色纖維素性滲出物。因此綜合臨床剖檢病變和微生物學診斷結(jié)果可以初步判定送檢病雞為大腸桿菌感染病例。5株細菌分離物在各種培養(yǎng)基上的生長特性符合大腸桿菌生物學特性及細菌分離物對多種抗菌藥物具有耐藥性且對小白鼠和雛雞具有致病性。

4、討論

大腸桿菌病是臨床常見的細菌性疾病之一，常常和其它細菌性和病毒性疾病并發(fā)，是目前危害我國畜牧業(yè)發(fā)展的一大難題。近些年來，隨著集約化養(yǎng)殖程度的提高和抗菌藥物的不合理使用等造成了大量的菌株出現(xiàn)了耐藥性，有的抗菌藥物甚至失效。因此，臨床上應合理應用抗菌藥物以避免或減少耐藥性的產(chǎn)生。藥敏試驗一方面可以快速地檢測病原菌對藥物敏感程度，合理地指導臨床用藥；另一方面還可以作為大腸桿菌耐藥性流行病學調(diào)查的一個重要參數(shù)，為準確地判斷和分析大腸桿菌耐藥的原因提供參考[6]。大腸桿菌對多種藥物敏感，但極易產(chǎn)生耐藥性[7]；為了防治大腸桿菌病，雞場經(jīng)常應用大量的抗生素，導致了細菌耐藥性的增加，為該病的防治帶來了極大困難[8]。建議各地區(qū)治療雞大腸桿菌病時要定期輪換用藥，最好先進行藥敏試驗，選出敏感藥物進行有效治療，避免因盲目用藥造成經(jīng)濟損失[9、10]。

大腸桿菌病是一種以大腸埃希氏菌引起的傳染病，在自然條件下，可發(fā)生在不同日齡的雞，但雛雞更易感[11]。本病一年四季均有發(fā)生，但以冬春寒冷和氣溫多變季節(jié)多發(fā)近年來，雞大腸桿菌病在河北省永清縣養(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶中頻繁發(fā)生，且有發(fā)病早、流行快、抗藥性強、死亡率高及混合感染等特點，為了控制該病的發(fā)生，最大程度地減少經(jīng)濟損失，應嚴格雞舍內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生，加強消毒、通風換氣，以及防止飼料污染，保持舍內(nèi)溫度的恒定。