BTH處理對(duì)甜瓜苗期抗蔓枯病相關(guān)POD和PPO酶活性的影響

郭勤衛(wèi)　王紅英　李季等

摘 要： 研究了BTH處理和蔓枯病病原菌接種對(duì)甜瓜抗蔓枯病相關(guān)的POD和PPO的影響，結(jié)果表明，BTH處理能有效提高不同甜瓜品種對(duì)蔓枯病的抗性。BTH處理第1、2和4天，抗蔓枯病品系‘PI420145和蔓枯病感病品種‘伊麗莎白的第3葉和第5葉的POD和PPO酶活性均高于對(duì)照；BTH和蔓枯病病原共同處理第1、3、5、7天，‘PI420145和‘伊麗莎白的第3葉和第5葉的POD和PPO酶活性高于蔓枯病病原菌處理；所有的處理中‘PI420145的POD和PPO的酶活性均高于‘伊麗莎白。表明POD和PPO酶活性與甜瓜對(duì)蔓枯病的抗性呈正相關(guān)。

關(guān)鍵詞： 甜瓜； 蔓枯病抗性； BTH處理； POD； PPO

甜瓜是一種世界性的蔬菜作物[1]。蔓枯病是一種危害十分嚴(yán)重的土傳真菌病害，在田間、溫室和日光溫室都有發(fā)生，能夠?qū)μ鸸系纳a(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-7]。中國(guó)是世界首要的甜瓜生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)，目前甜瓜的生產(chǎn)也受到蔓枯病的危害。

BTH是一種廣譜的抗真菌防護(hù)劑[8-9]，能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性，已在煙草[10]、棉花[11]、小麥[12]、水稻[13]、西瓜[14]、黃瓜[15]和甜瓜[16]等作物上廣泛應(yīng)用，并取得了良好的效果。

植物系統(tǒng)獲得抗性是一種廣譜的生物防護(hù)體系，能對(duì)特定的真菌和外界其他環(huán)境的刺激使植物產(chǎn)生相應(yīng)的抗性[17]。其調(diào)節(jié)機(jī)制之一是對(duì)防護(hù)相關(guān)的酶活性的調(diào)節(jié)[18]。POD是細(xì)胞壁主要成分木質(zhì)素合成途徑中的一種關(guān)鍵酶，POD酶活性與植物抗性相關(guān)物質(zhì)的合成和植物系統(tǒng)性誘導(dǎo)抗性呈正相關(guān)[19]。PPO是多酚化合物氧化過程的關(guān)鍵酶，通常被作為細(xì)胞的氧化指標(biāo)[20]。羅嬋娟等[21]用BTH 處理橡樹古銅期葉片，發(fā)現(xiàn)POD酶活性顯著高于對(duì)照，橡樹對(duì)白粉病的抗性也有顯著的增強(qiáng)。張俊華等[22]通過測(cè)定接種Phytophthora capsici的南瓜屬不同作物的POD和PPO活性，發(fā)現(xiàn)POD和PPO酶活性與其抗病能力緊密相關(guān)。王紅英等[23]通過測(cè)定不同抗性的甜瓜，發(fā)現(xiàn)感病品種PPO酶的活性顯著高于抗性品種。

本研究是在前人研究BTH在誘導(dǎo)甜瓜產(chǎn)生蔓枯病抗性的基礎(chǔ)上，測(cè)定與抗病相關(guān)的氧化酶活性，明確BTH誘導(dǎo)甜瓜產(chǎn)生蔓枯病抗性與其抗氧化酶活性的關(guān)系，并試圖說明其誘導(dǎo)抗性產(chǎn)生的生理生化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料：‘PI420145為抗蔓枯病甜瓜自交系，由美國(guó)康乃爾大學(xué)Molly John教授提供；‘伊麗莎白為感蔓枯病甜瓜品種，由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心提供?？共『透胁〔牧暇?jīng)過本課題組多代自交。

供試菌種：蔓枯病菌為本實(shí)驗(yàn)室分離純化并保存的A型菌株，菌株的分生孢子在僅含磷酸二氫銨的馬鈴薯平板培養(yǎng)基上，經(jīng)7 d暗培養(yǎng)和4 d間歇紫外燈（12 h紫外燈/12 h黑暗）處理的光照條件下產(chǎn)生[24]。

供試試劑：BTH由日本株式會(huì)社生產(chǎn)，其他試劑均為國(guó)內(nèi)分析級(jí)試劑。

1.2 方法

選取大小一致的甜瓜種子，溫湯浸種，種植在裝有蛭石、珍珠巖為3 ∶ 1 基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中，苗期，每隔1 d澆 1/2-Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，土壤持水量保持在75%。

1.3 試驗(yàn)處理

參照代春燕等[25]試驗(yàn)處理方法并稍作修改。在甜瓜5葉1心期，對(duì)第3葉噴施含有50 mg·L-1 的BTH溶液，以噴施不含BTH的溶劑為對(duì)照，7 d后，進(jìn)行蔓枯病菌接種，蔓枯病孢子懸浮液的接種濃度為1×105個(gè)·mL-1，并覆膜在相對(duì)濕度為92%～95% 的條件下保濕，然后在處理后第1、2、4、7、9、11、13天，每個(gè)處理分別取第3和5葉作為樣品，液氮保存，每重復(fù)5株，相同樣品混合組成混樣池，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.4 生理指標(biāo)測(cè)定

參照Mu[n][～]oz-Mu[n][～]oz 等[26]測(cè)定POD的方法，并稍作修改。酶液提?。悍Q取2 g樣品液氮研磨成粉末，加入6 mL 50 mmol·L-1預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH 7.8）在4 ℃ 條件下，提取20 min，轉(zhuǎn)入離心管中在4 ℃、12 000 × g下離心20 min，上清夜即為酶粗提液。反應(yīng)混合液的配制：取50 mL PBS（pH6.0，0.2 mol·L-1）緩沖液于燒杯中，加入28 μL愈創(chuàng)木酚（2-甲氧基酚）于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至溶解愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后加入19 μL 30% 的H2O2，混勻后保存于冰箱中備用。參照孔祥生和易現(xiàn)峰[27]測(cè)定PPO的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 BTH和蔓枯病接種對(duì)甜瓜葉片POD酶活性的影響

從表1可以看出，經(jīng)BTH處理后，‘伊麗莎白和‘PI420145第3葉POD酶活性逐漸升高，處理4 d后，分別為相應(yīng)對(duì)照的1.43和1.26倍；經(jīng)蔓枯病病原菌接種處理后，‘伊麗莎白和‘PI420145第3葉POD酶活性同樣呈上升趨勢(shì)，處理7 d后，分別為相應(yīng)接種第1天的1.49和1.83倍；經(jīng)BTH+蔓枯病病原菌接種處理后，‘伊麗莎白第3葉POD酶活性的變化趨勢(shì)與接種蔓枯病病原菌處理的變化趨勢(shì)相同，處理7 d后，活性為BTH+接種蔓枯病病原菌處理1 d后的2.41倍，為接種蔓枯病病原菌接種7 d后的1.67倍，‘PI420145第3葉POD酶活性呈現(xiàn)先升高，處理第5天達(dá)到峰值，約為相應(yīng)病原菌接種處理的2.62倍，而后下降。

經(jīng)BTH處理后，‘伊麗莎白第5葉POD酶活性略有下降，而后逐漸升高，處理4 d后，為對(duì)照的1.29倍，‘PI420145第5葉POD酶活性的變化趨勢(shì)和BTH處理第3葉的變化趨勢(shì)相同，處理4 d后，為對(duì)照的1.34倍；，經(jīng)蔓枯病病原菌接種處理后和BTH+蔓枯病病原菌接種時(shí)，‘伊麗莎白和‘PI420145第5葉POD酶活性的變化趨勢(shì)和相應(yīng)處理第3葉的酶活性變化趨勢(shì)相同。

所有處理中，‘PI420145第3和5葉的POD酶活性均高于相應(yīng)處理的‘伊麗莎白的。

2.2 BTH和蔓枯病接種對(duì)甜瓜葉片PPO酶活性的影響

從表2可以看出，經(jīng)BTH處理后，‘伊麗莎白和‘PI420145第3葉PPO酶活性略有升高；經(jīng)蔓枯病病原菌接種處理后，‘伊麗莎白第3葉PPO酶活性先下降，而后上升趨勢(shì)，處理7 d后，約為病原菌接種處理第1天的1.81倍，‘PI420145第3葉PPO酶活性逐漸升高，處理7 d后，約為病原菌接種處理第1天的1.57倍；經(jīng)BTH+蔓枯病病原菌接種處理后，‘伊麗莎白第3葉PPO酶活性的變化趨勢(shì)與接種蔓枯病病原菌處理的變化趨勢(shì)相同，處理7 d后，約為BTH+接種蔓枯病病原菌處理1 d后的1.26倍，為接種蔓枯病病原菌接種7 d后的1.42倍。經(jīng)BTH+蔓枯病病原菌接種處理后，‘PI420145第3葉PPO酶活性大體呈上升趨勢(shì)，處理后7 d，約為BTH+蔓枯病病原菌接種處理第1 d的2.5倍，約為相應(yīng)病原菌接種處理的1.83倍。

經(jīng)BTH處理后，‘伊麗莎白和‘PI420145第5葉的PPO酶活性均逐漸升高，處理4 d后，分別約為相應(yīng)對(duì)照的1.35和1.63倍；經(jīng)蔓枯病病原菌接種處理后和BTH+蔓枯病病原菌接種時(shí)，‘伊麗莎白和‘PI420145第5葉PPO酶活性變化趨勢(shì)均為先升高，處理后5 d達(dá)到峰值，而后出現(xiàn)不同程度的下降。

在所有的處理中，‘PI420145第3和第5葉的PPO酶活性均高于相應(yīng)處理‘伊麗莎白的。

3 討 論

前人研究表明，植物的抗病能力與抗病基因的有無(wú)、表達(dá)的快慢、表達(dá)的程度和表達(dá)產(chǎn)物的積累數(shù)量有密切的關(guān)系[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，在BTH處理后抗病品系‘PI40145的POD和PPO酶活性顯著高于感病品種‘伊麗莎白，可能是由于抗病品系‘PI420145存在抗病基因或是其抗病基因的表達(dá)速度快或表達(dá)量多于感病品種‘伊麗莎白。

本研究證明BTH處理以后，‘PI40145和‘伊麗莎白葉片的POD和PPO酶活性顯著高于相應(yīng)對(duì)照，與BTH處理橡膠樹觀察到的結(jié)果類似[21]，由此推測(cè) POD和PPO酶在BTH處理提高甜瓜對(duì)蔓枯病抗性的過程中起到關(guān)鍵性的作用。

植物系統(tǒng)獲得性抗性能通過SA的積累途徑，使植物對(duì)真菌病害產(chǎn)生抗性[17]，BTH與SA的作用效果類似[8-9]，并且其保護(hù)作用能夠傳到整個(gè)植物體[29]，因此，這也可能是BTH處理甜瓜品種第3葉后，第5葉的POD和PPO酶活性也得到提高的原因。

4 結(jié) 論

BTH通過增加POD和PPO酶活性使甜瓜獲得對(duì)蔓枯病的抗性。BTH處理能夠誘導(dǎo)植物未處理部分產(chǎn)生抗性，表明其能夠?yàn)檎麄€(gè)植株提供抗病性。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，‘PI420145和‘伊麗莎白的POD和PPO酶活性變化，在BTH和蔓枯病接種處理中有些不同，抗病品系‘PI420145的酶活性提高程度要高于感病品種‘伊麗莎白的。

參考文獻(xiàn)

[1] Gomez-Guillamon M L，Moriones E，Luis-Artega M，et al. Morphological and disease resistance evaluation in Cucumis melo and its wild relatives[M]. Alexandra Va： American Society of Horticultural Science，1998.

[2] Frantz J D，John M M. Five independent loci each control monogenic resistance to gummy stem blight in melon（Cucumis melo L.）[J]. Theor Appl Genet，2004，108： 1033-1038.

[3] Crosby K M，Miller M E，Wolff D W. Screening plant introductions of Cucumis melo for resistance to Monosporascus cannonballus[M]. Alexandra Va： American Society of Horticultural Science，2002.

[4] McCreight J D. Reactions of 20 melon cultigens to powdery mildew race 2 U.S.[M] Alexandra Va： American Society of Horticultural Science，2002.

[5] Wako T，Sakata Y，Sugiyama M. et al. Identification of melon accessions resistant to gummy stem blight and genetic analysis of the resistance using an efficient technique for seedling test[J]. Acta Hort，2002，588： 161-164.

[6] Bruton B D. Soil borne diseases in Cucurbitaceae： Pathogen virulence and host resistance[M]. Alexandra Va： American Society of Horticultural Science，1998.

[7] Tsutsumi C Y，Silva N D. Screening of melon populations for resistance to Didymella bryoniae in greenhouse and plastic tunnel conditions[J]. Braz Arch Biol Technol，2004，47（2）： 171-177.

[8] Gorlach J，Volrath S，Knauf-Beiter G，et al. Benzothiadiazole，a novel class of inducers of systemic acquired resistance，activates gene expression and disease resistance in wheat[J]. Plant Cell，1996，8 ： 629-643.

[9] Kunz W，Schurter R，Maetzke T. The chemistry of benzothiadiazole plant activators[J]. Pestic Sci，1997，50： 275-282.

[10] 王 濤，陳澤鵬，萬(wàn)樹青，等. 苯丙噻二唑（BTH）誘導(dǎo)煙草康青枯病活性與抗病機(jī)理研究[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2008，14： 29-32.

[11] Moshe I，Hamed D，Dan G. Induction of systemic acquired resistance in cotton by BTH has a negligible effect on phytophagous insects [J]. Entomologia Experimentalis et Applicata，2001，99（7）： 65-70.

[12] 陳 鵬，李振歧. BTH誘導(dǎo)小麥對(duì)白粉病的抗性與幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性誘導(dǎo)的關(guān)系[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，35（7）： 137-140.

[13] 宋鳳鳴，葛秀春，鄭 重，等. 苯丙噻二唑誘發(fā)水稻對(duì)白葉枯病的系統(tǒng)獲得抗性[J]. 中國(guó)水稻科學(xué)，2001，15（4）： 323-326.

[14] 閆 濤，彭 斌，吳會(huì)杰，等. BTH誘導(dǎo)西瓜甜瓜抗病毒病研究[J]. 中國(guó)瓜菜，2009（4）： 4-7.

[15] 王 莉，黃麗麗，康振生，等. BTH 誘導(dǎo)黃瓜對(duì)霜霉病的抗性[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2005，35 （3）： 274-277.

[16] 陳年來，朱振家，代春燕，等. BTH誘導(dǎo)不同抗性水平甜瓜抗白粉病的效應(yīng)[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2010，27（5）： 764-769.

[17] Walters D R，Paterson L，Walsh D J. et al. Priming of plant defense in barley provides benefits only under high disease pressure[J]. Physiol Mol Plant Pathol，2009，73： 95-100.

[18] 毛曉英，張玉玲，李茂盛，等. BTH對(duì)新疆甜瓜抗病性的誘導(dǎo)研究[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，42（3）： 158-161.

[19] Madge Y G，Terrence L G. Rapid accumulation of anionic peroxidases and phenolic polymers in soybean cotyledon tissues following treatment with Phytophthora megasperma f. sp. Glycinea Wall Glucan[J]. Plant Physiol，1991，97： 1445-1455.

[20] Mayer A M. Polyphenol oxidases in plants and fungi： going places [J]. A Review. Phytochemistry，2006，67： 2318–2331.

[21] 羅嬋娟，范志偉，沈奕德，等. BTH誘導(dǎo)橡膠樹對(duì)白粉病的抗性效果和相關(guān)酶活性測(cè)定[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2011，32（3）： 475-479.

[22] 張俊華，崔崇士. 不同抗性南瓜品種感染Phytophthora capsici病原菌后集中酶活性測(cè)定[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，34（2）：124-128.

[23] 王紅英，錢春桃，張永兵，等. 不同抗性甜瓜接種蔓枯病菌后若干生理指標(biāo)的變化[J]. 中國(guó)瓜菜，2012，25（1）： 7-10.

[24] 李 英，張永兵，Wolukau J N，等. 甜瓜蔓枯病菌子實(shí)體法分離及A型菌株產(chǎn)孢條件研究[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2007，24（1）： 84-88.

[25] 代春燕，朱振家，安翠香，等. 誘抗劑BTH誘導(dǎo)甜瓜幼苗抗白粉病相關(guān)酶活性的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，26（2）： 286-291.

[26] Mu[n][～]oz-Mu[n][～]oz J L，García-Molina F，García-Ruiz P A. et al. Enzymatic and chemical oxidation of trihydroxylated phenols[J]. Food Chemistry，2009，113（2）： 435-444.

[27] 孔祥生，易現(xiàn)峰. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2008： 125-126.

[28] 胡景江，劉志龍，文建雷. 潰瘍病菌低聚糖激發(fā)子誘導(dǎo)楊樹細(xì)胞抗病機(jī)制的初步研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，31（4）： 146-148.

[29] 毛曉英，吳慶志，李學(xué)文，等. BTH對(duì)新疆甜瓜過氧化物酶的系統(tǒng)誘導(dǎo)作用[J]. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27（4）： 31-35.