響應(yīng)面法優(yōu)化　對蝦蝦頭蛋白酶酶解工藝

王媛

中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis），又稱東方對蝦，是我國分布最廣的對蝦類。中國對蝦是中國的特產(chǎn)，因其營養(yǎng)豐富，滋味鮮美，且具保健功能，是我國重要的出口水產(chǎn)品，廣受國際市場歡迎。而在蝦類加工過程中，大量的蝦頭被當(dāng)作廢物丟棄，既浪費了資源，又對環(huán)境造成極大的污染。蝦頭中富含蛋白質(zhì)，同時游離氨基酸的種類較齊全，含量豐富，尤其是呈鮮味和甘味氨基酸，是提取優(yōu)質(zhì)蛋白的良好原料。用酶解技術(shù)獲得的對蝦蝦頭酶解液含有大量的游離氨基酸，可以用于調(diào)味品的增香，提高鮮度，增加風(fēng)味料的濃度，是調(diào)味珍品。

本文以中國對蝦蝦頭為原料，研究堿性蛋白酶酶解溫度、酶解pH值、酶與底物比對蝦頭水解度的影響，以期得到蝦頭酶解的最佳工藝條件并為蝦頭廢棄物綜合利用提供技術(shù)支持。結(jié)果表明，蝦頭酶解的最佳工藝條件為：酶解溫度62.0℃、酶解pH值9.1和酶與底物比1988U/g；經(jīng)驗證此條件下蝦頭酶解液水解度達到24.08%，與預(yù)測值24.38%基本相符。

材料與儀器

新鮮中國對蝦蝦頭（收集于贛榆縣農(nóng)貿(mào)市場，洗凈，晾干表面水分，用高速組織搗碎機粉碎備用）；檸檬酸、氫氧化鈉、甲醛、鹽酸等試劑（國產(chǎn)分析純）；堿性蛋白酶（國產(chǎn)食品級生化試劑，測定活力為2.95X104U/g）。

AB104-N分析天平（梅特勒-托利多）；HH.CP-101型恒溫水浴箱（上海賀德）；GS-100S型高速離心機（上海賀德）；DS-1型高速組織搗碎機（上海標(biāo)本模型廠）；101A-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海市試驗儀器總廠）；SW-CJ-1F型超凈工作臺（蘇州安泰技術(shù)公司）；DZHH-5型電動試管振蕩器（上海賀德）；BCD-205UT型電冰箱（青島海爾）；PHS-3C精密PH計（上海精密科學(xué)儀器）；其他常規(guī)玻璃儀器。

實驗方法

1.蝦頭成分測定

（1）水分：采用105℃恒重法（GB 5009.3-2010）；

（2）灰分：采用高溫灼燒法；

（3）蛋白質(zhì)含量的測定：采用GB 5009.5-2010中的凱氏定氮法測定；

（4）脂肪含量的測定：采用GB 5009.6-2003中的索氏抽提法。2.總揮發(fā)性鹽基氮的測定

采用微量擴散法。

3.游離氨態(tài)氮

采用甲醛電位滴定法。

4.水解度（DH）的測定

采用以下公式計算：DH（%）=（FANFAN0）×100/（N1-FAN0）；式中FAN0為蝦頭的游離氨基態(tài)氮；FAN為酶解液中的游離氨態(tài)氮；N1為總氮。5.酶解工藝流程

蝦頭漿→加水調(diào)pH→恒溫水浴振蕩酶解→粗過濾→鈍化酶（沸水浴10min）→離心→取上清液過濾→DH測定。

6.操作要點

（1）通過對比酸性蛋白酶（酶解溫度55℃、pH5.0）、中性蛋白酶（酶解溫度55℃、pH7.0）、堿性蛋白酶（酶解溫度60℃、pH9.0）和木瓜蛋白酶（酶解溫度50℃、pH5.5）4種蛋白酶的生物活性，并以水解度（DH）、總揮發(fā)性鹽基氮（TVBN）和酶解液風(fēng)味的感官評定作為主要評價指標(biāo)，篩選出最佳水解酶為堿性蛋白酶。

（2）依據(jù)單因素實驗結(jié)果并參考經(jīng)驗值，固液比不是影響對蝦頭酶解工藝的主要因素，確定固液比為1∶2。

（3）總揮發(fā)性鹽基氮（TVBN）是指肉、魚類樣品浸液在弱堿性下能與水蒸汽一起蒸餾出來的總氮量，主要是氨和胺類（三甲胺和二甲胺），常用蒸餾法或Conway微量擴散法定量。一般氨基酸、蛋白質(zhì)類等含氮高的食品，如魚、蝦、貝類及肉類，在需氧性敗壞時，常以測定揮發(fā)性鹽基氮含量的多少作為評定的化學(xué)指標(biāo)。通過實驗過程的TVBN值測定與感官判斷相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)當(dāng)TVBN值超過45mg/100mL時，水解液已有異味出現(xiàn)，這主要是由于蝦頭中微生物形成產(chǎn)物腐敗所致。所以，當(dāng)TVBN值達到45mg/100mL時停止水解。

7.響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，試驗選取堿性蛋白酶酶解溫度（55℃、60℃、65℃）、酶解pH值（8.5、9.0、9.5）、酶與底物比（1750U/g、2000U/g、2250U/g）3個因素為自變量，以TVBN值達到45mg/100mL時的水解度為響應(yīng)值，并根據(jù)BoxBenhnken模型的中心組合試驗設(shè)計原理，采用響應(yīng)面法設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)分析試驗，各因素水平編碼值見表1。

比較圖1～3并結(jié)合表4中p可知：刪除不顯著項AB、BC，所以將上述回歸方程修正為：Y=23.91+1.26A+1.47B-0.73C-1.68AA+0.41AB-2.85BB-1.25CC。通過計算得到最佳工藝參數(shù)為酶解溫度62.0℃、酶解pH值9.1和酶與底物比1988U/g。

3.優(yōu)化工藝的驗證

為檢驗Box-Benhnken模型試驗設(shè)計所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化出的工藝參數(shù)重復(fù)實驗3次，實際測得的平均水解率為24.08%，與預(yù)測值24.38%基本相符。因此，Box-Benhnken模型試驗設(shè)計所得的最佳工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實用價值。

結(jié) 論

在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)BoxBenhnken模型試驗設(shè)計原理，選取酶解溫度、酶解pH值、酶與底物比為試驗影響因素，以蝦頭水解度為響應(yīng)值，對試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到酶解溫度、酶解pH值、酶與底物比3個因素的二次多項回歸模型，對回歸模型進行分析，得出蝦頭酶解最佳工藝為：堿性蛋白酶作為水解酶，酶解溫度62.0℃、酶解pH值9.1和酶與底物比1988U/g。在該條件下蝦頭的水解度為24.38%。為了驗證最佳工藝條件，在此條件下測得蝦頭實際水解度為24.08%，與理論預(yù)測值的誤差為1.2%，說明采用該法優(yōu)化得到的蝦頭酶解工藝可靠。