羅格列酮誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

李艷麗

【摘 要】目的：研究羅格列酮對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。方法：MTT法檢測(cè)RGZ處理Hela細(xì)胞后的增殖活性并繪制生長(zhǎng)抑制曲線(xiàn)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hela細(xì)胞凋亡率，Wstern檢測(cè)Hela細(xì)胞Survivin和Livin蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果：RGZ能呈劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性的抑制Hela的增殖（P<0.01）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)以RGZ處理Hela細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴(lài)性上升 （P<0.01）。Western檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Hela細(xì)胞Survivin和Livin蛋白表達(dá)顯著下降 （P<0.01）。結(jié)論：RGZ能抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和并誘導(dǎo)凋亡，其作用機(jī)制與下調(diào)Survivin和Livin蛋白表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)健詞】宮頸癌；增殖；凋亡

宮頸癌發(fā)病率居女性惡性腫瘤的第二位，嚴(yán)重威脅著婦女的生命和健康。雖然發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)成功地降低了宮頸癌的發(fā)病率和死亡率。但在很多發(fā)展中國(guó)家，宮頸癌仍然是這些地區(qū)主要的惡性腫瘤之一，資料顯示，每年有超過(guò)50萬(wàn)的宮頸癌新發(fā)病例，其中90%來(lái)自發(fā)展中國(guó)家[1]。目前雖然宮頸癌的治療取得了較好的臨床效果，但預(yù)后仍有較多不盡人意之處。因此，尋找行之有效的化療藥物具有十分重大的意義。羅格列酮（Rosiglitazone，RGZ）為臨床常用的糖尿病治療藥物，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)它能抑制乳腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖，但尚未見(jiàn)其對(duì)人宮頸癌細(xì)胞系作用的報(bào)道。本文旨在研究RGZ對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討其抗腫瘤活性的機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

人宮頸癌Hela細(xì)胞株購(gòu)自購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基和新生牛血清購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。羅格列酮（Rosiglitazone，RGZ）購(gòu)自葛蘭素史克公司公司。UA和碘化丙啶 （propidium iodide，PI）染料和噻唑藍(lán)（MTT）及二甲基亞砜 （dimethyl sulfoxide，DMSO）試劑購(gòu)自Sigma公司。Survivin和Livin及β-actin抗體均購(gòu)自Santa Cruz。辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記物山羊抗小鼠IgG（二抗）和堿性磷酸酶顯色試劑盒購(gòu)于北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理

Hela細(xì)胞接種于含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含100 u/ml青霉素和100 u/ml鏈霉素）中，37℃，5%CO2，飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2.2MTT法檢測(cè)RGZ對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞按200μl/孔細(xì)胞懸液（1×105個(gè)細(xì)胞/ml）接種于96孔板。加入RGZ終濃度為12.5、25、50、100μmol/L的DMEM完全培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和空白對(duì)照，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h每孔加入5mg/ml MTT溶液20μl。終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加入DMSO 150μl震蕩10分鐘，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上于570nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度值（A值）。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照組A值-給藥組A值） /對(duì)照組A值×100%。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡細(xì)胞

收集12.5、25、50、100μmol/L RGZ作用24h后的Hela細(xì)胞，輕輕吹打制備單細(xì)胞懸液細(xì)胞。細(xì)胞懸液移入離心管，4℃，500×g，離心5min。棄上清液，冰預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次。上流式細(xì)胞儀雙染檢測(cè)凋亡計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Western蛋白印跡法檢測(cè)RGZ對(duì)Hela細(xì)胞Survivin和Livin蛋白表達(dá)表達(dá)的影響

收集12.5、25、50、100μmol/L RGZ作用24h后的Hela細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。SDS-PAGE 凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。加一抗抗體靜置過(guò)夜，TBST漂洗，加入二抗孵育后熒光顯色，沖洗。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS 6.12和SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2結(jié)果

2.1 RGZ對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響

RGZ具有顯著抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的作用，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性；不同濃度組間、不同時(shí)間組間生長(zhǎng)抑制率均有顯著性差異（F=28.205，P<0.01）（圖1）。

圖 1 RGZ抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的時(shí)效和量效關(guān)系

2.2 RGZ對(duì)Hela細(xì)胞凋亡率的影響

空白對(duì)照組的Hela細(xì)胞的凋亡率較低，經(jīng)12.5、25、50、100μmol/L RGZ作用24h后，細(xì)胞凋亡率分別為5.3±2.96、11.85±3.72、16.05±3.91、24.83±4.46。與對(duì)照組1.22±0.94相比，不同濃度組間細(xì)胞凋亡率有顯著性差異（F=11.322，P<0.01）（圖2）。

圖2 不同濃度RGZ作用后Hela細(xì)胞凋亡率分析

2.3 RGZ對(duì)Hela細(xì)胞Survivin和Livin蛋白表達(dá)表達(dá)的影響

經(jīng)12.5、25、50、100μmol/L RGZ RGZ作用24h后Hela細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)明顯降低，分別降低至0.84±0.09、0.67±0.07、0.49±0.12、0.28±0.14，與對(duì)照組的0.95±0.13比較，不同濃度組間有顯著性差異（F=10.201，P<0.01）；Hela細(xì)胞Livin蛋白表達(dá)明顯降低，分別降低至0.76±0.13、0.63±0.1、0.49±0.11、0.34±0.14，與對(duì)照組的0.81±0.11比較，不同時(shí)間組間有顯著性差異（F=16.135，P<0.01）。

圖3 不同濃度RGZ作用后Hela細(xì)胞Survivin和Livin蛋白的表達(dá)

3討論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ （PPARγ）的特異性配體能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，其中在肺癌和前列腺癌患者的臨床治療中，PPARγ配體已表現(xiàn)出了良好的抑瘤效果[2]。羅格列酮屬噻唑烷二酮類(lèi)藥物（thiazolidinediones，TZDs）是PPARγ激動(dòng)劑，對(duì)PPARγ親和力大，特異性強(qiáng)，且毒副作用輕，近年研究顯示，羅格列酮能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的終末分化，其機(jī)制可能是阻滯腫瘤細(xì)胞周期、抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲及血管生成等[3-4]。目前尚未見(jiàn)其對(duì)人宮頸癌細(xì)胞系作用的報(bào)道。本文旨在研究RGZ對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討其抗腫瘤活性的機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。本研究證實(shí)RGZ對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞有顯著的增殖抑制作用并呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性。本實(shí)驗(yàn)還觀(guān)察了RGZ對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的影響：流式細(xì)胞儀可發(fā)現(xiàn)RGZ作用后宮頸癌Hela細(xì)胞的凋亡率高于對(duì)照組，成時(shí)間依賴(lài)性上升，表明RGZ可有效地誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞的凋亡。

本研究結(jié)果認(rèn)為RGZ能夠抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。作為重要的免疫營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，RGZ在腫瘤研究中有著重要的作用，但其作用途徑和機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究。

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