HIV感染窗口期及其檢測技術(shù)進(jìn)展

【摘 要】獲得性免疫缺陷綜合征即艾滋病在全世界流行現(xiàn)狀十分嚴(yán)峻，無有效的治療方法、無有效預(yù)防疫苗，健康教育和行為干預(yù)是遏制艾滋病流行的最有效手段，因此應(yīng)早發(fā)現(xiàn)艾滋病病毒（HIV）感染者并采取措施控制其流行。在HIV感染窗口期體內(nèi)已有艾滋病病毒，處于窗口期的感染者同病人一樣具有傳染性，所以縮短窗口期時間盡早檢測出HIV，對控制艾滋病流行有重要意義。本文綜述了實(shí)驗(yàn)室在HIV窗口期按照檢測的標(biāo)志物分為：HIV抗體、HIV-1P24抗原、HIV核酸、細(xì)胞培養(yǎng)等檢驗(yàn)方法。

【關(guān)鍵詞】HIV；艾滋?。淮翱谄?；檢測技術(shù)

獲得性免疫缺陷綜合征即艾滋?。ˋIDS）是由人類免疫缺陷病毒（HIV）感染所引起的一種嚴(yán)重的傳染性疾病，主要經(jīng)性傳播、血液及母嬰傳播，具有傳播迅速、發(fā)病緩慢、病死率高的特點(diǎn)。自1985我國檢測出首例艾滋病病人以來，HIV感染人數(shù)逐年增加，AIDS在高危人群中呈明顯的上升趨勢[1]。在HIV感染后，最先檢測到病毒的RNA，然后是P24抗原，最后是抗體。人體感染了HIV后，一般需要2周時間才能逐漸產(chǎn)生病毒抗體?！按翱谄凇北举|(zhì)是病毒感染后在體內(nèi)復(fù)制定植和機(jī)體反應(yīng)的過程：從無到有、由少到多，即HIV感染到抗體檢測陽性的這段時間，一般為2周～12周。在此期間，雖然血液中檢測不到病毒抗體，但是同樣具有傳染性。縮短窗口期，及早發(fā)現(xiàn)感染者，對于控制HIV流行有重要的作用。隨著檢測技術(shù)的不斷進(jìn)展，HIV感染窗口期逐漸縮短。

1 抗體檢測

窗口期包含有兩方面含義：一是機(jī)體還沒有真正對HIV產(chǎn)生特異性的體液免疫而產(chǎn)生HIV抗體，微生物感染機(jī)體后1周左右最先產(chǎn)生IgM抗體，隨后出

現(xiàn)IgG抗體；二是抗體已產(chǎn)生，但是還未達(dá)到檢測方法的最低檢出限值，也歸為窗口期。

ELISA法

ELISA法是臨床上應(yīng)用最廣泛的檢測技術(shù)，至今仍在血液篩查中普遍應(yīng)用。它具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、結(jié)果判斷指標(biāo)客觀、結(jié)果便于紀(jì)錄和保存等優(yōu)點(diǎn)，既可用于單個樣本的測定，也適合大批標(biāo)本檢測。其檢測試劑現(xiàn)已發(fā)展到第4代。

1.1.1 1985年美國生產(chǎn)了第1個HIV抗體檢測試劑并應(yīng)用于臨床獻(xiàn)血員的篩查，此即為第1代HIV診斷試劑。該試劑用HIV全病毒裂解物為包被抗原，采用間接酶聯(lián)免疫法檢測HIV IgG抗體，檢測的窗口期大約為10周[2]。該試劑由于包被的抗原來自宿主細(xì)胞因而易發(fā)生假陽性反應(yīng)，并且所檢測的血清需要高度稀釋，敏感性和特異性較低。盡管如此，第1代HIV檢測試劑的出現(xiàn)仍然具有重要的意義。

1.1.2 隨著基因工程技術(shù)迅速發(fā)展，1990年5月第二代使用基因重組或合成多肽抗原的HIV診斷試劑盒面試。雖然仍然是利用間接酶聯(lián)免疫法檢測，但該試劑使用重組或合成的抗原多肽為包被抗原檢測血液中的HIV IgG抗體，保證敏感性的同時特異性也有了很大提高，可以將窗口期縮短至33～35 d[3]。同時由于第一代試劑盒只含有HIV-1抗原，而HIV-1抗原與HIV-2抗原的核苷酸序列相差40%，因此檢測HIV-1抗體的試劑盒對HIV-2抗體陽性的標(biāo)本靈敏度較低，常發(fā)生漏檢，針對此種情況第二代診斷試劑盒中出現(xiàn)了HIV-1/HIV-2抗體診斷試劑盒盒，這種試劑盒盒在包被的抗原中又加入了HIV-2抗原（gp36多肽），使得在一次試驗(yàn)中可同時檢測HIV-1和HIV-2抗體，既節(jié)約了時間和人力，又節(jié)約了成本。第二代試劑盒與第一代相比，特異性有明顯的提高。

1.1.3 1994年美國研究出了第3代HIV檢測試劑。它改變了過去間接酶聯(lián)免疫法的檢測原理，利用雙抗原夾心法檢測標(biāo)本中的抗體，同時酶標(biāo)記物也由過去的IgG抗體改為HIV特異抗原，進(jìn)一步提高了敏感性。此外，由于在非洲發(fā)現(xiàn)了HIV-1O群，而用HIV-1/HIV-2試劑檢測時常出現(xiàn)假陰性，因此在第3代試劑中又加入了HIV-1O群的抗原。第3代試劑可以同時檢測出HIV IgG、IgM、IgA等不同抗體亞型，同時不需將標(biāo)本過度稀釋來保證反應(yīng)的特異性，具有較高的敏感性，窗口期也由35d縮短至22d[2]，因而成為國際上的主流檢測試劑。目前，我國國產(chǎn)第3代HIV診斷試劑盒在敏感性、特異性方面已達(dá)到國際先進(jìn)水平[4]。

1.1.4 1998年，國際上研制出了第4代HIV檢測試劑。這種試劑將針對p24抗原的抗體與HIV-1/HIV-2型抗原一起包被于固相載體，并不影響HIV抗體的檢測，進(jìn)一步縮短了窗口期，其敏感性也較第3代試劑有所提高。在對第四代試劑盒的研究中發(fā)現(xiàn)p24抗原滴度降低與血清陽轉(zhuǎn)過程中未降低S/CO值，也沒有發(fā)現(xiàn)第四代試劑盒檢測陰性而第三代試劑盒檢測為陽性的樣本，所以未在p24抗原血癥和血清抗體陽性轉(zhuǎn)之間引入診斷的第2個窗口期。第四代由于可同時檢測艾滋抗原和抗體，未完善的HIV感染的篩查試劑盒，而且酶聯(lián)免疫法檢測HIV p24抗原操作簡便，成本低廉，可以在普通實(shí)驗(yàn)室得到普及[5]?；谶@一特點(diǎn)，在不久的將來，第4代試劑取代第3代試劑，成為高危人群血液篩查，提高輸血安全性的主要檢測試劑[6]。

許文燕等[7]的研究表明，與第3代試劑相比，第4代試劑可將檢測窗口期平均提前4～8d，但與單獨(dú)的抗原檢測試劑盒相比要滯后2～4d。張麒等[8]也通過評估第4代試劑對靜脈吸毒者感染窗口期的檢測能力得出結(jié)論：第4代試劑臨床檢測特異性為99.2%，假陽性率為0.8%。朱紹汶等[9]用第3代和第4代檢測試劑檢測了69650例無償獻(xiàn)血者樣本，發(fā)現(xiàn)第4代檢測試劑在無償獻(xiàn)血人群中檢出HIV感染者的敏感性為100%，特異性達(dá)了到99.93%。Malm等[10]分別用3種不同的第4代試劑檢測了40000份血清樣本，發(fā)現(xiàn)其檢測特異性均超過了99%。Pandori等[11]研究發(fā)現(xiàn)第4代試劑對急性期和近期HIV感染的檢出率達(dá)到了89%，對于抗體陰性，HIV RNA陽性者的檢出率也達(dá)了到80%。

Speers等[12]針對第4代試劑提出了“第2窗口期”的概念，其原因是p24抗原于感染后2～3周即可檢出，然后隨著抗體的產(chǎn)生，p24抗原濃度開始下降，在這段時間內(nèi)既檢測不到p24抗原也檢測不到抗體，稱為“第2窗口期”。盡管這種情況很少見，但也提示應(yīng)注意“第2窗口期”的存在。

2抗原檢測

在窗口期，病毒抗體不能被檢出，但可以檢測到病毒相關(guān)抗原或分離病毒。抗原能夠在個體感染后先于血清轉(zhuǎn)化2～18天被檢測到[13]，因此，通過檢測P24抗原可以作為早期診斷HIV感染的一種方法。p24抗原一般采用ELISA雙抗體夾心法檢測。 HIV-1p24抗原檢測的靈敏度為30%～90%，該結(jié)果僅作為HIV感染的輔助診斷依據(jù)，不能據(jù)此確診檢測結(jié)果陰性只表示在本試驗(yàn)中無反應(yīng)，不能排除HIV感染，臨床上一般不作為常規(guī)診斷項(xiàng)目[14]。

為了提高檢測血清中p24抗原的敏感性，研究者將血清中免疫復(fù)合物解離后再進(jìn)行測定，發(fā)展了免疫復(fù)合物裂解法（ICD）p24抗原測定法。該法是用加熱或酸、堿處理的方法使抗原抗體復(fù)合物分離，從而增加p24抗原的濃度，提高檢出率[15]。Sutthent等[16]將免疫復(fù)合物熱解離后，通過酪胺信號放大系統(tǒng)（TSA）使用ELISA法進(jìn)行檢測，使p24抗原的最小檢出值由原來的10pg/ml降低0.5pg/ml。在HIV-1抗體陽性母親所生嬰兒早期的鑒別診斷中與RNA檢測相當(dāng)，與HIV核酸檢測具有可比性，具有重要的實(shí)用價值。Workman等[17]采用超順磁性顆粒為標(biāo)志物，用磁珠免疫層析的方法檢測HIV-1p24抗原，可在40 min內(nèi)完成。此方法易操作，為HIV-1 p24抗原檢測提供了一種方便、低成本的快速檢測方法。

3 核酸檢測

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，核酸檢測得到了人們越來越多的重視，它可直接檢查HIV RNA，可在發(fā)現(xiàn)血清學(xué)變化之前檢測HIV感染，而且比P24抗原檢測方法更靈敏。簡單的說就是病毒感染人體后，一般情況下可通過一系列檢測被發(fā)現(xiàn)，而最早能被檢測到的是病毒核酸?，F(xiàn)有的酶聯(lián)免疫等血清學(xué)檢測方法檢測的是抗原或抗體，而核酸檢測技術(shù)檢測的是病毒核酸，所以能更早地發(fā)現(xiàn)病毒感染。HIV核酸檢測是檢測病毒的RNA，通常用血漿HIV-RNA的拷貝數(shù)來表示病毒復(fù)制的數(shù)量，即病毒載量。常用的病毒載量檢測方法有 逆 轉(zhuǎn) 錄PCR法（RT-PCR）、核酸序列擴(kuò)增試驗(yàn)（NASBA）和分支DNA擴(kuò)增試驗(yàn)（BDNA）等。3種方法的原理不盡相同，前兩者屬于靶擴(kuò)增，后者屬于信號擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄PCR靠高溫變性-低溫退火-中溫延伸的反復(fù)循環(huán)完成核酸的指數(shù)擴(kuò)增，而NSBA是在等溫條件下的核酸擴(kuò)增技術(shù)。

近幾年隨著分子生物學(xué)的發(fā)展而發(fā)展起來的熒光實(shí)時定量PCR檢測技術(shù)使HIV核酸檢測進(jìn)入到一個新境界。這種方法是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號實(shí)時監(jiān)測PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。該技術(shù)改變了傳統(tǒng)的終點(diǎn)檢測，實(shí)現(xiàn)了PCR從半定量到定量的飛躍。2002年4月我國已經(jīng)批準(zhǔn)生產(chǎn)了第一個HIV熒光PCR檢測試劑盒。

4 病毒培養(yǎng)

病毒培養(yǎng)是檢測HIV感染最精確方法。一般采取培養(yǎng)外周血單個核細(xì)胞（PBMC）的方法，進(jìn)行HIV診斷[18]。細(xì)胞培養(yǎng)的方法檢測HIV[19-20]專一性強(qiáng)，不會出現(xiàn)假陽性，對于確認(rèn)那些抗原/抗體檢測不確定的個體和陽性母親新生兒是否感染HIV有著重要意義。但是病毒培養(yǎng)的方法必須要有一定數(shù)量的感染細(xì)胞存在才能培養(yǎng)和分離出病毒來[21]，因而敏感性差、操作時間長、操作復(fù)雜，必須在特定的P3實(shí)驗(yàn)室中才能進(jìn)行，并且費(fèi)用昂貴，因此極少用于窗口期的檢測。

HIV感染者處于窗口期時，通常不能檢測到患者體內(nèi)抗體，而患者體內(nèi)由于大量病毒存在傳染性極強(qiáng)，因此如何在提高檢測靈敏度、特異性，縮短窗口期及早發(fā)現(xiàn)感染者的同時，達(dá)到檢測快速、操作自動化和降低成本的目的，將是HIV臨床檢測技術(shù)的未來研究方向。 隨著科技進(jìn)步，相信不久的將來，高靈敏、高特異、低成本的HIV檢測技術(shù)將會誕生。

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作者簡介：

葉瑞國（1978-），男，大學(xué)本科學(xué)歷，主管技師，現(xiàn)主要從事微生物檢驗(yàn)及管理工作。