臍血間充質干細胞的分離培養(yǎng)鑒定及誘導分化研究

潘麗杰　陳妍　袁杰

[摘要]目的：分離培養(yǎng)人臍血間充質干細胞（ human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells， hUCB-MSC），體外觀察其生長特性，并在特定條件下誘導分化，探討其成脂成骨分化能力。方法：采用沉降法和密度梯度離心結合貼壁培養(yǎng)法自臍血中分離間充質干細胞，倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)及生長情況；流式細胞儀分析細胞周期并檢測細胞表面標志物；用茜素紅染色和油紅O染色分別鑒定其成骨成脂分化能力。結果：純化的hUCB-MSC貼壁生長，呈均一梭形，具有較強的增值能力，流式細胞儀分析P3代hUCB-MSC穩(wěn)定表達間充質干細胞表面抗原標志 CD73，CD105 和 CD90 等，不表達造血標志 CD34 和 CD45；成骨誘導后3周后細胞茜素紅染色陽性；成脂誘導3周后細胞油紅O染色陽性。結論：本實驗分離的hUCB-MSC具有較強的增殖能力，表達間充質干細胞的表面標記， 具有成骨成脂分化潛能。

[關鍵詞]臍血；間充質干細胞；分化；鑒定

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）07-0735-04

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs），作為一種成體干細胞用于再生醫(yī)學修復各種間葉組織如骨、軟骨、肌肉等，具有廣闊的發(fā)展空間[1-2]，目前應用較為廣泛為骨髓間充質干細胞，但由于骨髓取材屬有創(chuàng)操作且干細胞隨供體年齡增大有老化傾向等問題，在一定程度上限制其臨床應用[3]。與骨髓間充質干細胞相比，臍血干細胞來源廣泛，采集方便，不會對供者造成任何傷害，且有研究顯示患者接受異體移植后，臍血來源的MSCs顯示出更低的免疫原性反應[4-5]所以人臍血MSCs引起越來越多研究者的廣泛興趣。但是關于間充質干細胞的含量及能否成功體外培養(yǎng)存在很大爭議。因此，本實驗即探討hUCB-MSCs的分離培養(yǎng)及其生物學特性，以期建立穩(wěn)定的體外分離培養(yǎng)體系；同時對其體外誘導分化能力也進行深入研究，以期為下一步研究奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料：所有標本均取自哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一臨床醫(yī)學院婦產科順產及剖宮產的胎兒，孕婦體健，乙肝五項、梅毒等檢測均為陰性，胎兒無先天性疾病，取血前征得產婦及家屬同意并簽署知情同意書。0.25%胰蛋白酶/EDTA、DMEM/F12（美國， Hyclone），胎牛血清FBS（美國，Gibco），人淋巴細胞分離液（1.077 g/ml，天津TBD公司），地塞米松、維生素C、吲哚美辛、β-甘油磷酸鈉、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）和胰島素均購自美國Sigma公司。熒光標記小鼠抗人單克隆抗體：CD45-PE、CD34-APC、CD90-FITC、 CD105-FITC和CD73-PE均購自美國biolegend公司。

1.2 方法

1.2.1 hUCB-MSC的分離與培養(yǎng)[6]：經(jīng)新生兒父母同意，采集新生兒臍血12份，每份50～80 ml，將所采集樣本于4h內處理。將抗凝臍血用同體積的PBS稀釋一倍，混勻，再與37℃預溫的3%明膠等比混合，室溫下靜置至血漿與紅細胞界面形成后，吸取血漿層，2000 r/min離心5 min，收集細胞；用5 ml DMEM/F12重懸所得細胞，按2：1的體積比加到人淋巴細胞分離液（1.077g/ml）表面，2000 r/min離心20 min，離心后吸取懸于分離液面的白膜層，獲得單個核細胞。PBS洗兩次，用DMEM/F12培養(yǎng)基（含體積分數(shù)為10%胎牛血清、10μg/L堿性成纖維細胞生長因子bFGF、100U/mL青霉素和100 g/L的鏈霉素）懸浮上述細胞，計數(shù)，以1×107cells/ml濃度接種于25ml培養(yǎng)瓶，置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4天后首次換液，以后每3天換液一次。倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。細胞生長至 80%融合時，用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化，1：1傳代。第一代后細胞生長達到 80%～90%時按 1：3傳代。選用生長良好的P3代細胞做鑒定。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞周期：取P3代細胞，0.25%胰酶/EDTA消化，制備單細胞懸液，并調整細胞數(shù)為1×106個，70%冰乙醇固定30 min，PBS洗2次，40mg/L RNAse中處理后離心，加入10g/L碘化丙啶0.5ml，染色30min，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.3 hUCB-MSC表面標志的檢測：取P3代細胞，在細胞達到80%融合時，0.25%胰酶/EDTA消化，制備單細胞懸液，并調整細胞數(shù)為1×106個，PBS洗兩次，離心，棄上清，加入0.1mlPBS重懸，分別加入熒光標記的抗體及同型對照，室溫避光孵育 20min。流式細胞儀檢測CD90、CD105和CD73、CD45和CD34的表達情況。

1.2.4 hUCB-MSC分化能力檢測：①成骨誘導：取P3代細胞以5×104個/ml 接種于六孔板，用含10% FBS的 DMEM/F12 培養(yǎng) 24h，待細胞貼壁伸展后，實驗組換用礦化誘導液（含10nmol/Lβ-甘油磷酸鈉，50μg/ml 維生素C，1×10-7mol/L地塞米松、10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基），對照組僅用10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，每隔3天換液。鏡下觀察細胞復層生長并出現(xiàn)黃褐色結節(jié)后棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30min，1%茜素紅染色10min，鏡檢、照相；②成脂誘導：將P3代細胞以 5×104個/ml的密度接種于六孔板，用含10%FBS的DMEM/F12 培養(yǎng)24h，待細胞貼壁伸展后，換用成脂誘導液（含0.25μmol/L 地塞米松，0.5mmol/L IBMX，100mmo1/L 吲哚美辛，10μg/L 胰島素， 10% FBS 的DMEM/F12培養(yǎng)基），對照組不加誘導劑，每隔3天換液。鏡下觀察細胞內出現(xiàn)脂肪小滴后棄去成脂誘導液，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15min，油紅O染色15min，顯微鏡下觀察、照相。

2 結果

2.1 hUCB-MSC形態(tài)學觀察：原代培養(yǎng)初期含有多種細胞成分，大部分細胞未貼壁，細胞為圓形或球形血細胞，第4天可見散在單個細胞貼壁，呈卵圓形，紡錘形和短梭形，逐漸伸出細胞突起，但無明顯擴增；10天以后細胞體積增大，密度明顯增加，少數(shù) MSCs 呈多角形，大部分呈長梭形，細胞突起明顯，且向周圍伸展呈輻射狀和網(wǎng)狀生長；細胞培養(yǎng)約3～4周可達80%～90%融合即可傳代。傳代hUCB-MSC接種后 6～8h即可貼壁，細胞均勻散在分布，生長迅速，1周后可再次傳代。隨著換液和傳代，異質性細胞逐漸被去除，貼壁細胞呈均一的成纖維樣細胞，呈旋渦狀生長。見圖1。

2.4 hUCB-MSC分化能力鑒定：①成骨誘導：hUCB-MSCs 成骨誘導 1周時，細胞形態(tài)變化不明顯；3周時可見鈣化物形成，茜素紅染色可見胞漿中有大量的紅色鈣化基質沉積，對照組無此變化，見圖 3；②成脂誘導：hUCB-MSCs經(jīng)成脂誘導1周，生長明顯減慢， 細胞形態(tài)開始變得豐滿，胞體變大，胞漿豐富，誘導2周左右在細胞核周圍的胞漿內出現(xiàn)一些折光性強的圓形脂肪小滴。隨時間的延長，脂肪滴逐漸增多并融合成大脂肪滴。3周后固定，1%油紅O 染色可見細胞內有紅染脂滴，大小不等，部分脂滴發(fā)生融合，主要分布在細胞核周圍及其附近，對照組無此變化，見圖3。

3 討論

實驗在查閱大量文獻的基礎上對培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，首先選用含體積分數(shù)為10%FBS的DMEM/F12作為培養(yǎng)基，并加入bFGF，主要考慮以往試驗中已經(jīng)證明DMEM/F12能夠提高培養(yǎng)效率[7]，而bFGF在間充質干細胞生長的信號傳導中具有重要的作用[8]，促進間充質細胞貼壁。原代培養(yǎng)hUCB- MSC，主要有兩種形態(tài)的貼壁細胞：一類呈橢圓形或圓形，體積大，這類細胞不能進一步增殖達到融合，最終趨于死亡。Erices等[7]認為此類細胞可能來源于臍血的破骨祖細胞，Wexler等[9]認為這群細胞表達了造血干細胞標志，為造血干細胞來源。本實驗認為這類細胞來源于造血干細胞的可能性比較大，因為分離的單個核細胞大部分為造血干細胞，在培養(yǎng)中極易分化出造血系的細胞；另一類細胞呈均勻一致的長梭形，12份臍血標本有8份在第10天后出現(xiàn)大量MSCs，而圓形細胞很少，且MSCs增殖迅速，逐漸融合，傳代后生長也很迅速，傳3代后圓形細胞基本不見，剩下形態(tài)較為均一的漩渦樣生長的纖維樣細胞，即hUCB-MSC。流式分析顯示約近80%處于細胞周期的G0/G1期。這些細胞自我更新能力很強，表現(xiàn)為細胞在傳代后增殖迅速，可傳至第18代，與Goodwin 等[10]報道一致。

目前，間充質干細胞的鑒定一般有兩種方法，其一是通過表面標志物檢測，臍帶血間充質干細胞不表達或低表達造血干細胞的CDl4，CD34，CD45，不表達內皮細胞CD31，CDl44；表達CDl3，CD29，CD44，SH2（CDl05），SH3（CD73），CD90，SH4，HLA-I等[11]；另一種是從功能學上鑒定，即根據(jù)干細胞的生物學特性，在特定培養(yǎng)基中呈纖維細胞樣貼壁生長，表現(xiàn)為幼稚細胞的特性，能夠分化為至少兩種不同的子代細胞。結合上述兩種方法，本實驗中流式細胞儀檢測提示所分離培養(yǎng)的成纖維樣細胞表達 CD73、CD105、CD90，不表達造血細胞相關抗原 CD34、CD45，證明這些細胞是區(qū)別于造血細胞且具有高度增殖能力的處于未分化狀態(tài)的非定向干細胞。為進一步確定所純化的MSCs是否具有多向分化潛能，分別進行成骨、成脂誘導分化，結果顯示誘導3周后檢測到鈣化基質的沉淀與脂滴的形成，證明所培養(yǎng)MSCs具有多向分化潛能。

牙再生是利用組織工程原理形成組織、形態(tài)和功能與天然牙一樣或相似的礦化組織。其中種子細胞是牙再生的基礎與關鍵，目前牙源性干細胞為主要來源，但因其來源困難限制其應用，非牙源性干細胞如骨髓、脂肪、真皮來源的MSC逐漸被應用于牙再生研究。由于具有來源廣泛，易獲取且無倫理學限制，增殖分化能力更強等優(yōu)點，目前有研究呼吁將臍血間充質干細胞作為牙再生種子細胞進行研究[12]。為此，本實驗通過體外培養(yǎng)建立臍血間充質干細胞系，并探討其生物學特性。實驗結果表明體外分離的hUCB-MSC為長梭狀成纖維樣細胞，表達間充質干細胞標志，體外增值活力很強，經(jīng)特定條件誘導，細胞可向脂肪細胞和成骨細胞方向分化，表明建立的細胞系為MSC并具有多項分化潛能。下一步我們將利用發(fā)育期牙胚所提供的微環(huán)境誘導人臍血間充質干細胞，探討其牙向分化的可能性。hUCB-MSC可望作為種子細胞在牙齒再生組織工程學研究中有廣闊的應用前景。

[參考文獻]

[1]Granero -Molto F，Weis JA，Longobardi L，et al. Role of mesenchymal stem cells in regenerative medicine： application to bone and cartilage repair [J]. Expert Opin Biol Ther， 2008，8（3）：255-268.

[2]Zhou XZ，Leung VY，Dong QR，et al.Mesenchymal stem cell based repair of articular cartilage with polyglycolic acidhydroxyapatite biphasic scaffold [J].Int Artif Org，2008，31（6）：480-489.

[3]Stenderup K，Justesen J，Clausen C，et al. Aging is associated with decreased maximal life span and accelerated senescence of bone marrow stromal cells[J].Bone，2003，33（6）：919-926.

[4]Lee OK，Kuo TK，Chen WM，et al.Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood [J].Blood，2004，103（5）：1669-1675.

[5]Kleen TO，Kadereit S，F(xiàn)anning LR， et al. Recipient-specific tolerance after HLA -mismatched umbilical cord blood stem cell transplantntation[J].Transplantation，2005，80（9）：1316-1322.

[6]姚天華，湯曉雨，楊壯群，等.體外誘導人臍血間充質干細胞向軟骨細胞分化的初步研究[J].中國美容醫(yī)學，2007，16（4）：450-454.

[7]劉岱，趙玉明，晏曉青，等.人臍帶血間充質干細胞分離培養(yǎng)體系的優(yōu)化篩選[J].中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（10）：1839-1843.

[8]Ng F，Boucher S， Koh S， et al. PDGF， TGF-beta， and FGF signaling is important for differentiation and growth of mesenchymal stem cells（MSC）：transcriptional profiling can identify markers and signaling pathways important in differentiation of MSCs into adipogenic， chondrogenic，and osteogenic lineages [J].Blood，2008，112（2）：295-307.

[9]Erices A，Conget P，Minguell JJ.Mesenchymal progenitor cell in human umbilical cord blood [J].Br J Haematol，2000，109（1）：235-242.

[10]Wexler SA，Donaldson C，Denning-Kendall P，et al.Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal stem cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not[J].Br J Haematol，2003，121（2）：368-374.

[11]Goodwin HS，Bicknese AR，Chien SN，et al.Multilineage differentiation activity by cells isolated from umbilical cord blood： expression of bone，fat，and neural markers[J].Biol Blood Marrow Transplant.2001，7（11）： 581-588.

[12]Ji BH，Chen J，Wang H.Feasibility of stem cells from umbilical cord blood as seed cells for tooth regeneration[J].Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu，2010，14（32）： 6060-6063.

[收稿日期]2013-02-02 [修回日期]2013-03-28

編輯/張惠娟