EPO對(duì)大鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中VEGF變化影響及其與劑量、時(shí)間的相關(guān)性

呂大倫 丁偉 張煒 王合麗 徐祥 李子虎

【摘要】目的探討重組人促紅細(xì)胞生成素（LHEPO）對(duì)大鼠皮膚切創(chuàng)形成的急性創(chuàng)面愈合的影響。方法 健康SD雄性40只大鼠建立急性創(chuàng)面動(dòng)物模型，隨機(jī)分成低劑量組（50U/ LHEPO），中劑量組（100U/LHEPO），高劑量組（150U/LHEPO）和生理鹽水（NS）對(duì)照組， 造模同時(shí)進(jìn)行外敷不同劑量LHEPO及生理鹽水治療。觀察每組大鼠創(chuàng)面愈合情況，并于傷后 3d， 7d ，14d取創(chuàng)面皮膚標(biāo)本，免疫組織化學(xué)方法染色檢測(cè)創(chuàng)面VEGF的變化。結(jié)果與對(duì)照組比，治療7d后，中和高劑量LHEPO組大鼠創(chuàng)面愈合率均顯著增加（P < 0.05）；疫組化結(jié)果為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）在高劑量和中劑量藥物治療組皮膚組織中高表達(dá)，在同一時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組有顯著性差異（P<0.05）。結(jié)論LHEPO能促進(jìn)大鼠皮膚切創(chuàng)愈合創(chuàng)面微血管形成，加速創(chuàng)面愈合。

【關(guān)鍵詞】促紅細(xì)胞生成素；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子；創(chuàng)面愈合

【中圖分類號(hào)】 R64 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1004-4949（2013）07-194-02

創(chuàng)傷修復(fù)是一個(gè)涉及多種細(xì)胞及其產(chǎn)物協(xié)同對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行重建和再生的過程，在這一過程中， 新生組織的生成必須依托于新生血管的生成， 才有可能促進(jìn)創(chuàng)面快速愈合。目前已知作用于造血系統(tǒng)的促紅細(xì)胞生成素（ EPO）也能在體內(nèi)誘導(dǎo)新生血管的形成，具有較強(qiáng)的促血管生成的活性。本實(shí)驗(yàn)旨在通過大鼠建立急性創(chuàng)面動(dòng)物模型，探討重組人促紅細(xì)胞生成素（LHEPO）對(duì)對(duì)大鼠皮膚切創(chuàng)形成的急性創(chuàng)面愈合的影響，為創(chuàng)面修復(fù)尋找新的用藥及治療途徑提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 主要藥品：

重組人促紅素注射液（北京四環(huán)生物制藥有限公司，批號(hào)：20120543）；生理鹽水（杭州民生藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：41203274）。

1.2 動(dòng)物急性創(chuàng)面模型制作及分組：

雄性SD 大鼠40 只，體重200-220g，購自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（遼）2010-0001。SD大鼠于術(shù)前一天臀背部剃毛。10%水合氯醛以3.5ml/kg 的劑量腹腔注射麻醉， 在無菌條件下進(jìn)行皮膚切創(chuàng)造創(chuàng)手術(shù)：常規(guī)手術(shù)消毒，在大鼠背部近臀部以脊柱為中心，做一個(gè)直徑大約為2.5cm 的創(chuàng)面，切除皮膚達(dá)肌肉筋膜層，形成急性創(chuàng)面，將造模后40 只SD 大鼠隨機(jī)分成四組，即模型組，重組人促紅素注射液低劑量組、中劑量組和高劑量組，生理鹽水對(duì)照組，每組10 只。造模同時(shí)進(jìn)行外敷不同劑量重組人促紅素注射液及生理鹽水治療。各組大鼠每天創(chuàng)面用無菌生理鹽水進(jìn)行清理后，創(chuàng)面分別均勻濕敷 50U/mL、100 U/mL、150U/mL 重組人促紅素注射液及生理鹽水，每日1 次，每次1mL，于傷后14 d 停止給藥。觀察每組大鼠創(chuàng)面愈合情況，并分別在3d，7d，14d 取材檢測(cè)指標(biāo)。

1.3 觀察創(chuàng)面愈合率：每日拍照，游標(biāo)卡尺測(cè)量： 創(chuàng)面愈合面積率=（原始創(chuàng)面面積-殘余創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積× 100%

1.4血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）檢測(cè)：

采用免疫組化方法檢測(cè)VEGF表達(dá)。石蠟切片（4μm）常規(guī)脫蠟，逐級(jí)水化，先經(jīng)3 H2O2室溫下滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性20min，0.01 mol/L枸緣酸緩沖液行抗原修復(fù)，然后依次加入正常小牛血清（1：10）、VEGF（1：100）、生物素標(biāo)記的兔抗鼠抗體、生物素標(biāo)記羊抗兔抗體（1：200）、SP復(fù)合物 （1：200）。各步驟之間均經(jīng)37。C恒溫箱孵育3Omin，PBS沖洗（小牛血清除外），最后DAB染色，蘇木索復(fù)染，樹脂封片。用PBS代替一抗作為空白對(duì)照。胞漿有棕黃色或棕褐色顆粒者為陽性細(xì)胞。

在400倍鏡下，隨機(jī)選取10個(gè)左右陽性表達(dá)視野，進(jìn)行染色結(jié)果判斷：①根據(jù)著色的強(qiáng)弱對(duì)染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，0 分為無著色；1 分為淡黃色、略高于背景；2 分為棕黃色、明顯高于背景；3 分為強(qiáng)染、著棕褐色；②根據(jù)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)對(duì)染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，0～2 分為陰性（-）；3～4 分為弱陽性（+）；5～6 分為陽性（++）；7 分為強(qiáng)陽性（+++）。兩者相加為免疫組化評(píng)分，取其平均值作為陽性表達(dá)量。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組間均數(shù)比較用t 檢驗(yàn)處理，以P < 0.05 為差異具有顯著性。

2結(jié)果

2.1創(chuàng)面愈合面積率檢測(cè)：結(jié)果顯示，與對(duì)照組比，治療7d后，人促紅素注射液中和高劑量組大鼠創(chuàng)面愈合率均顯著增加（P < 0.05）。

2.2各組VEGF表達(dá)量：

免疫組化結(jié)果：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）在高劑量和中劑量藥物治療組皮膚組織中高表達(dá)，在同一時(shí)間點(diǎn)與模型組有顯著性差異（P<0.05）。具體結(jié)果如表2 和附圖2 所示。

3討論

促紅細(xì)胞生成激素（EPO）分子由165個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量為34kD，是體內(nèi)紅細(xì)胞增殖、分化以及維持外周循環(huán)紅細(xì)胞數(shù)量正常的最主要的調(diào)節(jié)因子。現(xiàn)有的研究表明 EPO 和 EPOR 不僅僅存在于幼紅細(xì)胞表面，也表達(dá)在不同的非紅細(xì)胞生成組織，如神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、心肌、平滑肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等[1]。最近研究發(fā)現(xiàn)[2]EPO外用重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)大鼠皮膚深Ⅱ°燙傷創(chuàng)面可明顯提高創(chuàng)面愈合面積率，縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間，加速創(chuàng)面愈合。Saher Hamed等[3]通過建立糖尿病大鼠全層皮膚缺損模型，創(chuàng)面局部應(yīng)用含不同劑量重組人促紅素的乳膏，治療后12天發(fā)現(xiàn)給予EPO的創(chuàng)面愈合率、微血管密度（MVD）、VEGF與HP含量均明顯高于對(duì)照組，創(chuàng)面細(xì)胞凋亡程度明顯抑制，并表現(xiàn)出EPO濃度依賴性，提示EPO可以促進(jìn)糖尿病大鼠創(chuàng)面的修復(fù)。Heiko Sorg等[4]研究發(fā)現(xiàn)重復(fù)低劑量EPO腹腔注射，也可以加速創(chuàng)面的愈合。如調(diào)控VEGF、內(nèi)皮素、誘導(dǎo)型NO合酶、促紅細(xì)胞生成素等的表達(dá)，從而促進(jìn)新生血管的形成和血管重構(gòu)，調(diào)節(jié)血管張力和改善血管通透性，增強(qiáng)糖酵解及血氧容量，使機(jī)體組織對(duì)缺血缺氧產(chǎn)生耐受與適應(yīng)，從而啟動(dòng)創(chuàng)面修復(fù)機(jī)制。此外，受HIF調(diào)節(jié)的VEGF是影響血管新生的關(guān)鍵生長(zhǎng)因子之一，是一種作用最強(qiáng)且唯一特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的促進(jìn)血管生成因子，它既可提高血管通透性，又可直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，刺激其分裂增殖，誘導(dǎo)新生血管生成并影響微血管的量，從而促進(jìn)創(chuàng)面的生長(zhǎng)愈合。

附圖

本研究結(jié)果表明，HLEPO外用可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合，縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間，其能夠促進(jìn)愈合的原因，可能與其在～定程度上上調(diào)VEGF的表達(dá)水平有關(guān)，改善局部缺血缺氧狀態(tài)，促使血管新生，并最終促進(jìn)創(chuàng)面愈合。這一新的外用藥物應(yīng)用可望為臨床創(chuàng)面修復(fù)開辟一條的新途徑。

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[3]Saher Hamed， Yehuda Ullmann， Muhannad Masoud， et al. Topical Erythropoietin Promotes Wound Repair in Diabetic Rats[J]， J Invest Dermatol，2010， 130.

[4]Heiko Sorg， Christian Krueger， Torsten Schulz， et al. Effects of erythropoietin in skin wound healing are dose related[J]， The FASEB Journal， Vol. 23 3049-3058.