TGF—α、MMP—9及P16在膽脂瘤型中耳炎中的表達(dá)及意義

李靖 馬慧敏

【摘要】

目的通過(guò)觀察轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子- α（transforming growthfactoralpha，TGF-α）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子16（P16）在中耳膽脂瘤上皮中的表達(dá)情況，分析TGF-α、MMP-9及P16之間的相關(guān)性，探討TGF-α、MMP-9、P16對(duì)中耳膽脂瘤侵襲能力的影響。方法收集膽脂瘤型中耳炎病人手術(shù)新鮮標(biāo)本60例，并以2O例外耳道皮膚（extemal ear canal skin，EACS）作為對(duì)照，迅速固定，制成石蠟切片，同時(shí)觀察病人的骨質(zhì)破壞程度。采用免疫組化技術(shù)，檢測(cè)探討轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-a（transforming growth factoralpha，TGF-α）、基質(zhì)金屬蛋白酶一9（Matrix metalloproteinases-9，MMP-9）與P16在60例膽脂瘤中的表達(dá)，同時(shí)觀察三者的表達(dá)與骨質(zhì)破壞程度的相互關(guān)系，探討膽脂瘤骨質(zhì)破壞的可能發(fā)生機(jī)制。結(jié)果膽脂瘤中耳炎患者較對(duì)照組皮膚中TGF-α、MMP-9及P16的表達(dá)有顯著性差異。結(jié)論 TGF-α與MMP-9兩者存在正相關(guān)，在膽脂瘤上皮中高表達(dá)，與膽脂瘤的侵襲能力及骨質(zhì)破壞程度密切相關(guān)，P16在膽脂瘤上皮的高度表達(dá)與侵襲能力無(wú)相關(guān)性，可能是抑制上皮高度增殖的原因之一。

【關(guān)鍵詞】膽脂瘤，中耳；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子16

【中圖分類號(hào)】R764 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1004-4949（2013）07-01-02

膽脂瘤中耳炎以中耳腔內(nèi)存在大量高度增殖的角化鱗狀上皮為主要的病理特征，對(duì)鄰近骨質(zhì)的侵襲及破壞是其嚴(yán)重的臨床特征[1]，可引起聽力下降，造成嚴(yán)重的顱內(nèi)外并發(fā)癥[2]，手術(shù)[3]切除是目前為止唯一有效的治療方法。但手術(shù)存在一定的復(fù)發(fā)率及并發(fā)癥，且部分患者術(shù)后聽力無(wú)法恢復(fù)甚至進(jìn)一步下降，TGF-α、MMP-9及P16在膽脂瘤中耳炎患者中高表達(dá)，因此本研究采用免疫組化技術(shù)和計(jì)算機(jī)圖像定量分析系統(tǒng)法檢測(cè)TGF-α、MMP-9及P16在中耳膽脂瘤上皮細(xì)胞中的表達(dá)，并與正常外耳道皮膚作比較，從細(xì)胞因子及細(xì)胞周期調(diào)控的角度探索膽脂瘤型中耳炎發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供提供一個(gè)新思路。

1材料與方法

1.1對(duì)象： 60例中耳膽脂瘤標(biāo)本均來(lái)源于2009年10月-2011年10月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科住院手術(shù)的膽脂瘤型中耳炎患者，并均被該院病理科病檢所證實(shí)。60例膽脂瘤患者中，男34例，女26例，年齡15～60歲，平均年齡40.70±1.18歲。其中20例膽脂瘤患者術(shù)中同時(shí)取外耳道骨段皮膚，作為正常對(duì)照。標(biāo)本于術(shù)中取出后立即用10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，作3～4um厚的連續(xù)切片。

1.2試劑： 兔抗人TGF-a多克隆抗體：武漢博士德生物工程有限公司；兔抗人MMP-9多克隆抗體：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人P16多克隆抗體：武漢博士德生物工程有限公司；PV6000試劑盒；抗體稀釋液；DAB顯色試劑盒。

1.3實(shí)驗(yàn)方法： 標(biāo)本采集后進(jìn)行HE常規(guī)染色及免疫組化染色前制備，制備好的每例標(biāo)本隨機(jī)抽取相鄰連續(xù)切片分別作HE常規(guī)染色及TGF-α、MMP-9及P16免疫組化染色，觀察這三種基因在實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中的表達(dá)情況，整個(gè)染色步驟嚴(yán)格按照試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 中耳膽脂瘤上皮與正常人外耳道皮膚之間TGF-α、MMP-9及P16表達(dá)陽(yáng)性率的比較用四格表x2檢驗(yàn)。兩兩指標(biāo)間相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，TGF-α、MMP-9、P16與中耳膽脂瘤侵襲能力的關(guān)系用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05，以P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用SPSSl3.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2結(jié)果

51例TGF-α陽(yáng)性片中有48例同時(shí)表達(dá)MMP-9，皆為陰性表達(dá)5例，表達(dá)不一致4例。對(duì)60例膽脂瘤標(biāo)本進(jìn)行計(jì)算機(jī)圖像分析，記錄三個(gè)指標(biāo)的次度值，經(jīng)spearman相關(guān)分析，TGF-α、MMP-9表達(dá)存在正相關(guān)（P<0.05），而P16與TGF-α、MMP-9之間均未發(fā)現(xiàn)線性相關(guān)關(guān)系（P>0.05）。

3討論

3.1TGF-α在有絲分裂原表皮生長(zhǎng)因子（EGF）家族中是一種重要的生長(zhǎng)因子，能誘導(dǎo)人類角質(zhì)細(xì)胞的增生、分化[4]，在許多鱗狀細(xì)胞癌及上皮增生性疾病中都發(fā)現(xiàn)有TGF-α，在60例膽脂瘤上皮組織中呈中等陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，在20例外耳道皮膚組織呈弱陽(yáng)性表達(dá)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。證明膽脂瘤上皮細(xì)胞中TGF-α含量增高、活性增強(qiáng)，反映了膽脂瘤上皮的高度增殖性。正常外耳道皮膚中TGF-α含量低，僅以維持上皮的正常增生、分化[5]。

3.2基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一組在結(jié)構(gòu)上具有極大同源性，能降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）蛋白的水解酶，在炎癥反應(yīng)、組織重建與修復(fù)、腫瘤血管生成及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，在特定的條件下幾乎所有的間質(zhì)細(xì)胞均能分泌。常見的有中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞[6-7]，其中MMP-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）以Ⅳ型膠原和明膠為作用底物，引起基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)[8-9]的降解，細(xì)胞外基質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)與功能被破壞，膽脂瘤產(chǎn)生的炎性產(chǎn)物和蛋白水解酶類通過(guò)基底膜與周圍骨質(zhì)接觸，清除骨組織的骨樣表面，促進(jìn)破骨細(xì)胞的活性，導(dǎo)致骨基質(zhì)的降解[10]，破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞在骨質(zhì)破壞過(guò)程中活性增強(qiáng)，分泌MMPs，并相互激活，降解骨基質(zhì)，從而成就膽脂瘤的侵襲力和破壞力。

3.3臨床上可以將膽脂瘤型中耳炎的骨質(zhì)破壞程度分為四級(jí)，分別為無(wú)明顯聽小骨破壞，破壞砧骨或錘骨，破壞砧骨和錘骨者，破壞砧骨、錘骨、蹬骨、乳突天蓋和乙狀竇骨板，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-α、MMP-9表達(dá)陽(yáng)性反應(yīng)越強(qiáng)的患者其顳骨CT所示骨質(zhì)破壞越嚴(yán)重，說(shuō)明膽脂瘤組織中TGF-α及MMP-9的表達(dá)水平越高骨破壞越重。

3.4p16基因又叫MTS（multiple tumor suppressor 1）基因，是美國(guó)Kamb等于1994年發(fā)現(xiàn)的新抗癌基因，直接參與細(xì)胞周期中的一種基本基因，參與調(diào)控細(xì)胞周期，可以阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及細(xì)胞分裂，本實(shí)驗(yàn)?zāi)懼錾掀づc外耳道正常上皮中P16的陽(yáng)性表達(dá)分別為65%及10%，二者之間表達(dá)差異[11]有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明膽脂瘤細(xì)胞具有高凋亡特性，P16在膽脂瘤上皮的高度表達(dá)可能是抑制上皮高度增殖的原因之一。

總之，在膽脂瘤形成過(guò)程中高增殖與高凋亡同時(shí)存在，兩者達(dá)到新的平衡，死亡細(xì)胞增多從而產(chǎn)生更多的角化物碎屑，排出受阻最終堆積形成膽脂瘤。膽脂瘤上皮中存在TGF-α、MMP-9與p16的高表達(dá)，且TGF-α、MMP-9兩者之間存在正相關(guān)，可能與骨質(zhì)破壞進(jìn)程關(guān)系密切，結(jié)合膽脂瘤患者的顳骨CT[12-13]了解骨質(zhì)破壞程度，進(jìn)一步推斷出TGF-α與MMP-9的表達(dá)水平，為將來(lái)有選擇性的干預(yù)其作用過(guò)程進(jìn)行臨床保守治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。p16基因治療控制膽脂瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖，可能會(huì)從根本上治療膽脂瘤。

參考文獻(xiàn)

[1]Muller J.Vonder geschichteten Perlmutter-glamzenden Fettgeschwulat：cholesteatoma. In：Uber den feineren Ball mad die Formen der krankhatten Geschwulste.Berlin，Germany：Reimer，1838：50.

[2]Tekin M.Osma U.Merie F，et a1.Clinical assessment of patients with chronic otitis media with eholesteatoma.Kulak Burum Bogaz Ihtis Derg，2002，9（4）：263-266.

[3]梁曉杰，楊仕明，韓東一，等.膽脂瘤型中耳炎顱內(nèi)外并發(fā)癥的臨床分析[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志；2005，40（1）：12.

[4]黃賽瑜，何秋香，高金建，項(xiàng)松潔；中耳炎患者肉芽組織和膽脂瘤中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α的表達(dá)[J].浙江臨床醫(yī)學(xué)；2005，5：26.

[5]Lang S，Schilling V，Wollenberg B，et a1.Localization of transforming growth factor-beta expression cells and comparison with major extraccUular components in aural cholestentoma.Ann Otol Rhinol Laryngol，1997，106（8）：669-673.

[6]Sheu JR，F(xiàn)ong TH，Liu CM，et al.Expression of matrix metallo-proteinase-9 in human platelets：regulation of platelet activation in vitro and in vivo studies[J].Br J Pharmacol，2004，143（1）：193-201.

[7]Wilson SR，Gallagher S，Warpeha k，et al.Amplification of MMP-2 and MMP-9 production by prostate cancer cell lines via activation of protease-activated receptors[J].Prostate，2004，60（2）：168-174.

[8]Akimoto R， Pawankar R，Yagi T，et al. Acquired and congenital cholesteatoma：determination of tumor necrosis factor-alpha， intercellular adhesion molecule-1，interleukin-1-alpha and lymphocyte functional antigen-1 in the inflammatory process.ORL J Otoehinolageynol Relat Spec，2000，62（5）：257-65.

[9]Sastry KV，Sharma SC，Mann SB，et a1.Aural cholesteatoma：role of tumor necrosis factor-alpha in bone destruction.Am J Otol，1999，20（2）：158-161.

[10]Eriko Shibosawa.Stromal expression of matrix metalloproteinases-9 inmiddle ear cholesteatoma.Am J Otol，2000，21（5）：621-624.

[11]吳瑞珊，黃方，楊勁松.CDK4、P16在中耳膽脂瘤中的表達(dá)及意義[J].山東大學(xué)耳鼻喉眼學(xué)報(bào)，2007，21（1）：28-31.

[12]方文輝，劉國(guó)瑞，鄭文斌，等.高分辨率CT診斷膽脂瘤型中耳炎[J].中國(guó)介入影像與診斷學(xué)，2005，2（4）：279-282.

[13]Swarttz JD.High resolution computed tomography of the middle ear and mastoid.Part I：normal radioanatomy including normal variations[J].Radiology，1983，148（2）：449-454.