液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定他克莫司的有關(guān)物質(zhì)

付曉婷，陳民輝，嚴(yán) 菲*，杭太俊

（1江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,南京 210019；2中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京 210009）

他克莫司（tacrolimus，圖1），即［3S-［3R，E（1S，3S，4S）］，4S，5R，8S，9E，12R，14R，15S，16R，18S，19S，26aR］］-5，6，8，11，12，13，14，15，16，17，18，19，24，25，26，26a-十六氫-5，19-二羥基-3-［2-（4-羥基-3-甲氧基環(huán)己基）-1-甲基乙烯基］-14，16-二甲氧基-4，10，12，18-四甲基-8-（2-丙烯基）-15，19-環(huán)氧-3H-吡啶并［2，1-c］［1，4］氧雜氮雜環(huán)二十三碳烷-1，7，20，21（4H，23H）-四酮，是從鏈霉菌屬發(fā)酵產(chǎn)物中分離出的23 元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素［1］，是強(qiáng)效免疫抑制劑，既用于器官移植，又用于自身免疫性疾病，如特應(yīng)性皮炎（AD）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、自身免疫性眼病等的治療［2-5］。

雖然英國(guó)和美國(guó)藥典已收載他克莫司及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，他克莫司的質(zhì)量研究也有一些文獻(xiàn)報(bào)道［6-9］，但是關(guān)于他克莫司有關(guān)物質(zhì)的系統(tǒng)研究與鑒定未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

Figure 1 Chemical structure of tacrolimus

本研究建立了適用于他克莫司有關(guān)物質(zhì)檢查和鑒定的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法，通過(guò)LC-QTOF/MS 測(cè)定了他克莫司及其強(qiáng)制降解樣品中35個(gè)有關(guān)物質(zhì)的準(zhǔn)確相對(duì)分子質(zhì)量和分子式，同時(shí)結(jié)合其二級(jí)質(zhì)譜特征，綜合解析鑒定它們的結(jié)構(gòu)，可用于他克莫司發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制。他克莫司在電噴霧正離子化時(shí)，［M+H］+峰很弱，主要形成［M+NH4］+和［M+Na］+峰；由于［M+Na］+離子響應(yīng)強(qiáng)同時(shí)產(chǎn)生碎片多，更有助于解析，故采用［M+Na］+進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

他克莫司原料藥（批號(hào)181201FK）、他克莫司粗品（批號(hào)PCR-181101）（江蘇九陽(yáng)生物制藥有限公司）；他克莫司及其有關(guān)物質(zhì)A、8-差向異構(gòu)體、8-丙基類似物（美國(guó)藥典USP對(duì)照品）。乙腈、甲基叔丁基醚（CR，美國(guó)Tedia 公司）；甲酸、磷酸（AR，南京化學(xué)試劑有限公司），娃哈哈純凈水，自制二次重蒸水。

1.2 儀 器

BS 21S 分析天平（德國(guó)Sartorius 公司）；LCMS9030 Q-TOF（日本島津公司）。

2 方 法

2.1 色譜條件

Agilent Eclipse Plus-C18（150 mm × 4.6 mm，3.5 μm）色譜柱；以0.01% 甲酸-乙腈-甲基叔丁基醚（80∶16∶4）水溶液為流動(dòng)相A 相，0.01%甲酸-乙腈-甲基叔丁基醚（20∶64∶16）為流動(dòng)相B 相，進(jìn)行線性梯度洗脫（A∶B）0 min（75∶25）→19 min（75∶25）→38 min（27.5∶72.5）→39 min（75∶25）→45 min（75∶25），檢測(cè)波長(zhǎng)為 220 nm，流速為1.5 mL/min，柱溫為60 ℃，進(jìn)樣量為20μL。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧正離子化，高分辨Q-TOF/MS 測(cè)定。NaI 溶液（4 × 104mol/L）準(zhǔn)確質(zhì)荷比校正，噴霧電壓4.00 kV，霧化氣壓力230 kPa，流量3.0 L/min，接口溫度300 ℃，干燥氣流量10.0 L/min，加熱氣流10.0 L/min，氬氣CID 碰撞能量45~55 eV，掃描范圍m/z 100~900。

2.3 溶液配制

2.3.1 供試品溶液 取他克莫司原料藥或供試品約15 mg，精密稱定，置5 mL 量瓶中，加稀釋劑（乙腈）溶解并定量稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為3 mg/mL 的供試品溶液。精密量取上述溶液適量，加稀釋劑定量稀釋制備0.1%自身對(duì)照溶液。

2.3.2 對(duì)照品溶液 取他克莫司有關(guān)物質(zhì)A、他克莫司8-差向異構(gòu)體、8-丙基類似物各適量，精密稱定，分別加稀釋劑溶解并定量稀釋制成含他克莫司有關(guān)物質(zhì)A、8-差向異構(gòu)體、8-丙基類似物均約10μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3.3 強(qiáng)制降解試驗(yàn)溶液 取他克莫司各約15 mg，分別經(jīng)光照（4 500 lx）7 d、或 100 ℃烘箱放置7 d；或稀釋劑溶解后，加0.1 mol/L 鹽酸溶液1 mL 60 ℃水浴反應(yīng) 4 h、加 0.001 mol/L 氫氧化鈉溶液1 mL 60 ℃水浴反應(yīng)4 h、加3% 過(guò)氧化氫溶液1 mL 60 ℃水浴中反應(yīng)2.5 h、或光照（4 500 lx）3.5 d、或90 ℃水浴中反應(yīng)24 h；制備強(qiáng)制降解樣品。然后，各樣品分別加稀釋劑（酸堿處理樣品先中和）溶解并稀釋至5 mL，配制成質(zhì)量濃度約為3 mg/mL 的強(qiáng)制降解試驗(yàn)溶液。同時(shí)進(jìn)行空白溶劑試驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 有關(guān)物質(zhì)檢查

建立的他克莫司有關(guān)物質(zhì)揮發(fā)性流動(dòng)相HPLC 檢查方法適用于質(zhì)譜聯(lián)用鑒定。現(xiàn)行藥典所使用的乙腈-甲基叔丁基醚-水流動(dòng)相體系效果較好，色譜圖中有關(guān)物質(zhì)18（后期經(jīng)解析為他克莫司異構(gòu)體Ⅰ自發(fā)脫水產(chǎn)生）雖呈鼓包狀，嘗試多種流動(dòng)相體系對(duì)峰形并無(wú)明顯改善，歸因?yàn)樗四九c其異構(gòu)體之間存在轉(zhuǎn)化的動(dòng)態(tài)平衡。

圖2 為他克莫司原料藥、粗品、已知雜質(zhì)對(duì)照品及其強(qiáng)制降解溶液的HPLC-UV 譜圖。采用0.1%自身對(duì)照法估算有關(guān)物質(zhì)的含量，按保留時(shí)間由小到大順序?qū)看笥?.1%主要雜質(zhì)進(jìn)行識(shí)別和編號(hào)，共檢出分離良好的35 個(gè)主要有關(guān)物質(zhì)，其中有關(guān)物質(zhì)18 和21 分別為他克莫司的互變異構(gòu)體Ⅰ和Ⅱ（均為他克莫司的有效成分）。

他克莫司原料藥供試品共檢出1 個(gè)有關(guān)物質(zhì)（有關(guān)物質(zhì)21，圖2-c），他克莫司粗品共檢出10 個(gè)有關(guān)物質(zhì)（有關(guān)物質(zhì) 3、14、17、21、22、23、25、26、29、31，圖2-k）。強(qiáng)制降解試驗(yàn)結(jié)果表明，本品在溶液降解狀態(tài)下，對(duì)酸、堿、氧化、光照、高溫條件均比較敏感；在固體粉末干法降解狀態(tài)下，對(duì)高溫、光照較為穩(wěn)定。酸降解形成14 個(gè)主要降解產(chǎn)物（有關(guān)物質(zhì)5 ~ 7、15、18、19、20、21、25、30 ~ 34，圖2-i）；堿降解形成7 個(gè)主要降解產(chǎn)物（有關(guān)物質(zhì)3、5、8、18、19、20、21，圖2-j）；氧化降解形成5 個(gè)主要降解產(chǎn)物（有關(guān)物質(zhì)1、2、4、18、21，圖2-h）；高溫濕法降解形成8個(gè)主要降解產(chǎn)物（有關(guān)物質(zhì)13、17、18、21、24、27、31、35，圖2-d）；光照濕法降解形成5個(gè)主要降解產(chǎn)物（有關(guān)物質(zhì)9、13、16、21、28，圖2-f）；光照干法降解形成產(chǎn)生2 個(gè)主要降解產(chǎn)物（有關(guān)物質(zhì)12、21，圖2-g）；高溫干法降解形成4個(gè)主要降解產(chǎn)物（有關(guān)物質(zhì)10、11、17、27，圖2-e）。

Figure 2 HPLC-UV chromatograms of tacrolimusa: Blank; b: 0.1% Reference; c: API; d:Wet heat; e: Dry heat; f: Wet light; g: Dry light; h: Oxidation; i: Acid; j: Alkaline; k: Crude; l: Reference of tacrolimus related substance A;m:Reference of tacrolimus 8-epimer;n:Reference of tacrolimus 8-propyl analogs

3.2 有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定

采用LC-Q-TOF/MS 測(cè)定各有關(guān)物質(zhì)母離子的準(zhǔn)確質(zhì)荷比和離子組成，以及它們的二級(jí)質(zhì)譜特征碎片，并通過(guò)與他克莫司和已知有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)譜特征進(jìn)行對(duì)比分析，鑒定各主要有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

3.2.1 已知有關(guān)物質(zhì)的確證 通過(guò)對(duì)有關(guān)物質(zhì)的HPLC定位及質(zhì)譜定性，確證有關(guān)物質(zhì)23、25、26分別與USP規(guī)定的已知有關(guān)物質(zhì)A、他克莫司8-差向異構(gòu)體、他克莫司8-丙基類似物對(duì)應(yīng)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和相對(duì)保留時(shí)間及在含水的溶劑中他克莫司的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象［7］，可以得出有關(guān)物質(zhì) 18 和 21 分別對(duì)應(yīng)他克莫司異構(gòu)體Ⅰ和Ⅱ。對(duì)他克莫司和各已知有關(guān)物質(zhì)的一級(jí)質(zhì)譜母離子準(zhǔn)確質(zhì)荷比、二級(jí)質(zhì)譜特征碎片離子（圖4）和裂解途徑分析，可以輔助其未知有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)的推斷與鑒定。

Figure 3 Chemical structures of the related substances(RS)1-35 of tacrolimus

Figure 4 Q-TOF/MS spectrum of tacrolimus'impurity reference substance 18(m/z 826),21(m/z 826),23(m/z 814),25(m/z 826)and 26(m/z 828)

他克莫司 ESI+-Q-TOF/MS 測(cè)得他克莫司［M+Na］+準(zhǔn)確質(zhì)荷比為 826.474 4，與離子式C44H69NO12Na+相應(yīng)；其主要碎片離子以及相應(yīng)的離子式為m/z 679.381 1（C38H56O9Na+）對(duì)應(yīng)［（P-111-2H2O）Na］+，m/z 653.403 0（C37H58O8Na+）對(duì)應(yīng)［（P-111-H2O-CO2）Na］+，m/z 635.391 1（C37H56O7Na+）對(duì)應(yīng)［（P-111-2H2O-CO2）Na］+，m/z 625.407 3（C36H58O7Na+）對(duì)應(yīng)［（P-111-H2O-CO2-CO）Na］+，m/z 616.310 1（C31H47NO10Na+）對(duì)應(yīng)［（P-210）Na］+，m/z 607.396 9（C36H56O6Na+）對(duì)應(yīng)［（P-111-2H2OCO2-CO）Na］+，m/z 505.240 8（C25H38O9Na+）對(duì)應(yīng)［（P-210-111）Na］+，m/z 487.229 7（C25H36O8Na+）對(duì)應(yīng)［（P - 210 - 111 - H2O）Na］+，m/z 443.240 3（C24H36O6Na+）對(duì)應(yīng)［（P-210-111-CO2-H2O）Na］+，m/z 415.245 7（C23H36O5Na+）對(duì)應(yīng)［（P-210-111-CO2-H2O-CO）Na］+，m/z 387.250 8（C22H36O4Na+）對(duì)應(yīng)［（P-210-111-CO2-H2O-2CO）Na］+，他克莫司的二級(jí)質(zhì)譜圖及推斷裂解途徑分別見(jiàn)圖5。可以看到他克莫司可以失去兩個(gè)特征的碎片m/z 111和m/z 210。特征碎片m/z 111（圖6）與2-甲酰哌啶-2-烯相對(duì)應(yīng)，在他克莫司、西羅莫司等斷裂途徑中都可以發(fā)現(xiàn)，是歸屬于大環(huán)內(nèi)酯類的一種特征碎裂方式，特征碎片m/z 210 的產(chǎn)生是由于羥基的孤對(duì)電子通過(guò)共價(jià)鍵轉(zhuǎn)移，羥基與反式氫發(fā)生消除脫水，同時(shí)酯鍵發(fā)生水解，酯鍵斷裂（圖7），同樣是大環(huán)內(nèi)酯類他克莫司、西羅莫司的一種特征碎裂途徑［10］。

有關(guān)物質(zhì)18、21 它們的二級(jí)質(zhì)譜特征碎片與他克莫司基本一致，分別對(duì)應(yīng)他克莫司的異構(gòu)體Ⅰ和Ⅱ［6-7］，他克莫司在含水的溶劑中會(huì)發(fā)生異構(gòu)體之間的相互轉(zhuǎn)化（圖8）。有關(guān)物質(zhì)18 與21 的相對(duì)保留時(shí)間與USP 所列出的異構(gòu)體Ⅰ和Ⅱ相對(duì)保留時(shí)間一致，ESI+-Q-TOF/MS測(cè)得有關(guān)物質(zhì)18與21 的［M+Na］+準(zhǔn)確質(zhì)荷比為826.473 7 與他克莫司一致。圖8 中可以看到異構(gòu)體Ⅱ是由于他克莫司19 位的羥基發(fā)生了差向異構(gòu)，而異構(gòu)體Ⅰ則是因?yàn)樗四?9 位為半縮醛結(jié)構(gòu)，結(jié)合1 分子水后會(huì)開環(huán)形成醛和醇，但異構(gòu)體Ⅰ結(jié)構(gòu)上的胞二醇結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定會(huì)自發(fā)脫去1分子水，這也就解釋了為什么有關(guān)物質(zhì)18的相對(duì)分子質(zhì)量并沒(méi)有比他克莫司多18。

有關(guān)物質(zhì)23 其結(jié)構(gòu)為他克莫司8 位的丙烯基變?yōu)榱艘一?，相?duì)分子質(zhì)量比他克莫司少12，由于結(jié)構(gòu)改變的位置位于他克莫司特征性失去碎片（m/z 111 和m/z 210）之外，故其二級(jí)質(zhì)譜特征碎片m/z 604.310 7（C30H47NO10Na+）對(duì)應(yīng)［（P-210）Na］+、m/z 475.231 0（C24H36O8Na+）對(duì)應(yīng)［（P-210-111-H2O）Na］+均相應(yīng)地比他克莫司的碎片少12。

有關(guān)物質(zhì)25 其結(jié)構(gòu)為他克莫司8 位的丙烯基構(gòu)型發(fā)生了翻轉(zhuǎn)，相對(duì)分子質(zhì)量與他克莫司相同，不涉及特征性失去碎片（m/z 111 和m/z 210）的改變，故其二級(jí)質(zhì)譜特征碎片m/z 616.310 5（C31H47NO10Na+）對(duì)應(yīng)［（P-210）Na］+，m/z 487.231 4（C25H36O8Na+）對(duì)應(yīng)［（P-210-111-H2O）Na］+與他克莫司相同。

有關(guān)物質(zhì)26 其結(jié)構(gòu)為他克莫司8 位的丙烯基變?yōu)榱苏?，相?duì)分子質(zhì)量比他克莫司多2，由于結(jié)構(gòu)改變的位置位于他克莫司特征性失去碎片（m/z 111 和m/z 210）之外，故其二級(jí)質(zhì)譜特征碎片m/z 618.326 3（C31H49NO10Na+）對(duì)應(yīng)［（P-210）Na］+，m/z 489.246 7（C25H38O8Na+）對(duì)應(yīng)［（P-210-111-H2O）Na］+均比他克莫司的碎片多2。

3.2.2 未知有關(guān)物質(zhì)的確證 通過(guò)有關(guān)物質(zhì)HPLC 定位及質(zhì)譜特征，以及未知有關(guān)物質(zhì)的一級(jí)質(zhì)譜母離子準(zhǔn)確相對(duì)分子質(zhì)量、二級(jí)質(zhì)譜特征碎片離子，結(jié)合他克莫司及已知有關(guān)物質(zhì)裂解規(guī)律，對(duì)各未知有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行綜合分析鑒定其結(jié)構(gòu)。根據(jù)結(jié)構(gòu)將其大致分為以下幾類：

Figure 5 Q-TOF/MS spectrum of tacrolimus[M+Na]+(m/z 826)ion and its fragmentation pathways

（1）半縮醛結(jié)構(gòu)重排成內(nèi)酯

Figure 6 Formation reaction of fragment m/z 111

Figure 7 Formation reaction of fragment 210

有關(guān)物質(zhì)1、2、4、5、8、12、13、19保留時(shí)間相對(duì)較弱而極性較大，且其二級(jí)質(zhì)譜特征碎片（圖9）均大致含有 m/z 659.412 3（641.403 6）與離子式C36H60O9Na+（C36H58O8Na+）相 應(yīng) 、m/z 449.250 4（431.241 2）與離子式C23H38O7Na+（C23H36O6Na+）相應(yīng)、m/z 421.254 9 與離子式 C22H38O6Na+相應(yīng)、m/z 403.245 9與離子式C22H36O5Na+相應(yīng)。由特征碎片可以看出上述所列有關(guān)物質(zhì)的特征碎片m/z 659.412 3（641.403 6）和 m/z 449.250 4（431.241 2）相差210，也就是可以失去他克莫司m/z 210 的特征碎片，m/z 111的碎片并未產(chǎn)生，參考TLC 已記錄的他克莫司雜質(zhì)對(duì)照品結(jié)構(gòu)［11］，又結(jié)合它們的保留特性及產(chǎn)生的條件推測(cè)這幾個(gè)雜質(zhì)共有的特點(diǎn)為半縮醛結(jié)構(gòu)處重排為內(nèi)酯。

有關(guān)物質(zhì)12/13 ESI+-Q-TOF/MS 測(cè)得有關(guān)物質(zhì)12和13的［M+Na］+準(zhǔn)確質(zhì)荷比分別為798.479 7與798.480 0，均與離子式C43H69NO11Na+相應(yīng)，m/z比他克莫司少28 對(duì)應(yīng)CO，結(jié)合其碎片特征以及與文獻(xiàn)已知雜質(zhì)比較，推測(cè)在光照條件下，半縮醛結(jié)構(gòu)開環(huán)后重排為內(nèi)酯，在此過(guò)程中母核可能發(fā)生結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)，故保留不同，形成有關(guān)物質(zhì)12/13。

有關(guān)物質(zhì)5 ESI+-Q-TOF/MS 測(cè)得有關(guān)物質(zhì)5的［M+Na］+準(zhǔn)確質(zhì)荷比為 844.485 0，與離子式C44H71NO13Na+相應(yīng)，m/z比他克莫司多18，元素組成多H2O。有關(guān)物質(zhì)5 在酸堿降解條件下產(chǎn)生，保留時(shí)間相對(duì)較弱，故推測(cè)有關(guān)物質(zhì)5是由于他克莫司在酸堿加熱的條件下酯鍵水解同時(shí)半縮醛結(jié)構(gòu)處重排為內(nèi)酯，其僅可以失去m/z 210 的特征碎片并未失去m/z 111，是因?yàn)榘肟s醛結(jié)構(gòu)重排為內(nèi)酯后18 位鍵更容易斷裂失去185+H2O 后產(chǎn)生m/z 641.401 7 的碎片，分子式組成與Q-TOF 生成分子式一致。

Figure 8 Chemical structure of tacrolimus and its isomers

Figure 9 Q-TOF/MS spectrum of RS 1/2,4,5,8,12/13,19[M+Na]+ion

有關(guān)物質(zhì)8 ESI+-Q-TOF/MS 測(cè)得有關(guān)物質(zhì)8的［M+Na］+準(zhǔn)確質(zhì)荷比為 659.416 4，與離子式C36H60O9Na+相應(yīng)，恰比有關(guān)物質(zhì)5 的碎片m/z 641.403 6 多18 對(duì)應(yīng)H2O，當(dāng)此碎片支鏈上羥基不脫去時(shí)為有關(guān)物質(zhì)8。為他克莫司在堿降解條件下產(chǎn)生。

有關(guān)物質(zhì)4 ESI+-Q-TOF/MS 測(cè)得有關(guān)物質(zhì)4的［M+Na］+準(zhǔn)確質(zhì)荷比為 842.470 0，與離子式C44H69NO13Na+相應(yīng)，質(zhì)荷比比有關(guān)物質(zhì)5 少2，元素組成少H2。有關(guān)物質(zhì)4在氧化降解條件下產(chǎn)生，故推測(cè)其結(jié)構(gòu)為他克莫司酯鍵水解以及半縮醛結(jié)構(gòu)重排為內(nèi)酯后酰胺鍵連接的羥基被氧化為了羰基。

有關(guān)物質(zhì)1/2 ESI+-Q-TOF/MS 測(cè)得有關(guān)物質(zhì)1 和 2 的［M+Na］+準(zhǔn)確質(zhì)荷比分別為 860.479 3 與860.479 0，均與離子式C44H71NO14Na+相應(yīng)，質(zhì)荷比比有關(guān)物質(zhì)4多18，元素組成多H2O，且其碎片離子也相應(yīng)比有關(guān)物質(zhì)4多18對(duì)應(yīng)H2O，又因?yàn)樗鼈冊(cè)谘趸到庀庐a(chǎn)生，故推測(cè)其與有關(guān)物質(zhì)4有類似的結(jié)構(gòu)，當(dāng)他克莫司酯鍵水解以及半縮醛結(jié)構(gòu)重排為內(nèi)酯后酰胺鍵連接的羥基被氧化為羰基繼而8位丙烯基的烯鍵被氧化為羥基，生成有關(guān)物質(zhì)1/2。在此過(guò)程中母核可能發(fā)生結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)，故保留不同。

有關(guān)物質(zhì)19 ESI+-Q-TOF/MS 測(cè)得有關(guān)物質(zhì)19 的［M+Na］+準(zhǔn)確質(zhì)荷比為853.484 5，與離子式C45H70N2O12Na+相應(yīng)，有關(guān)物質(zhì)19 質(zhì)荷比比他克莫司多27，元素組成多HCN。其與有關(guān)物質(zhì)5 具有相同的二級(jí)質(zhì)譜特征碎片，有關(guān)物質(zhì)19 在酸降解條件下產(chǎn)生，由于酸降解溶液為乙腈水溶液，故推測(cè)其結(jié)構(gòu)為他克莫司酯鍵水解以及半縮醛重排為內(nèi)酯后哌啶環(huán)上的羧基的羥基被腈基取代。

以上結(jié)構(gòu)以有關(guān)物質(zhì)5為例進(jìn)行解析，質(zhì)譜裂解均得到合理歸屬（圖10）。

（2）半縮醛結(jié)構(gòu)開環(huán)

有關(guān)物質(zhì) 6、7、15 ESI+-Q-TOF/MS 測(cè)得其［M+Na］+準(zhǔn)確質(zhì)荷比分別為844.485 2、844.485 2、844.485 0，均與離子式C44H71NO13Na+相應(yīng)，質(zhì)荷比比他克莫司多18 對(duì)應(yīng)H2O，觀察其二級(jí)質(zhì)譜特征碎片（圖11）可以發(fā)現(xiàn)它們［（P-111-210）Na］+、［（P-111）Na］+的相關(guān)碎片與他克莫司的一致，結(jié)合有關(guān)物質(zhì)6、7、15在酸降解條件下產(chǎn)生且保留較弱，極性較大，推測(cè)有關(guān)物質(zhì)6、7、15對(duì)應(yīng)他克莫司異構(gòu)體Ⅰ胞二醇結(jié)構(gòu)，在酸性加熱條件下，半縮醛結(jié)構(gòu)結(jié)合1分子水開環(huán)形成醛和醇，在此過(guò)程中母核可能發(fā)生構(gòu)型翻轉(zhuǎn)，因此存在立體異構(gòu)，故有關(guān)物質(zhì)6、7、15保留時(shí)間不同。

Figure 10 Fragmentation pathway of RS 5

Figure 11 Q-TOF/MS spectrum of RS 6,7,15[M+Na]+ion and their formation reaction

有關(guān)物質(zhì)20 ESI+-Q-TOF/MS 測(cè)得有關(guān)物質(zhì)20 的［M+Na］+準(zhǔn)確質(zhì)荷比為853.484 5，與離子式C45H70N2O12Na+相應(yīng)，有關(guān)物質(zhì)20 質(zhì)荷比比他克莫司多27，元素組成多HCN。其主要特征碎片（圖12）除 了 m/z 641.402 4、m/z 431.240 3、m/z 403.245 5，還產(chǎn)生了 m/z 742.410 3（C39H61NO11Na+）對(duì)應(yīng)［（P-111）Na］+、m/z 532.251 6（C26H39NO9Na+）對(duì)應(yīng)［（P-111-210）Na］+，故有關(guān)物質(zhì)20 除具有與有關(guān)物質(zhì)5 相似的裂解途徑，還可以失去m/z 111和m/z 210 的特征碎片，且特征碎片離子均比他克莫司的多27，故推測(cè)有關(guān)物質(zhì)20 為他克莫司在酸降解條件下，由于溶液為乙腈水溶液，半縮醛結(jié)構(gòu)開環(huán)后20位羰基活性較強(qiáng)發(fā)生加成反應(yīng)上去腈基。除酰胺鍵較易斷裂產(chǎn)生P-111 的碎片，其19 位和20位之間的鍵也較易斷裂產(chǎn)生641.402 4的碎片。

（3）5位羥基失水成雙鍵

Figure 12 Q-TOF/MS spectrum of RS 20[M+Na]+ion and its fragmentation pathway

有關(guān)物質(zhì) 30、31、32、33、34 ESI+-Q-TOF/MS測(cè)得其［M+Na］+準(zhǔn)確質(zhì)荷比分別為808.464 1、808.464 1、808.463 9、808.463 5、808.463 0，均與離子式C44H67NO11Na+相應(yīng)，質(zhì)荷比比他克莫司少18 對(duì)應(yīng)H2O，觀察其二級(jí)質(zhì)譜特征碎片（圖13）僅可以產(chǎn)生與m/z 111相關(guān)的碎片，由于特征碎片m/z 210的產(chǎn)生是由于5位羥基的孤對(duì)電子通過(guò)共價(jià)鍵轉(zhuǎn)移，羥基與反式氫發(fā)生消除脫水，同時(shí)酯鍵發(fā)生水解有關(guān)。5 個(gè)雜質(zhì)對(duì)應(yīng)的離子式以及主要特征碎片離子一致，故有關(guān)物質(zhì)30、31、32、33、34 為他克莫司5 位羥基脫水在5、6 位（7 位羰基的存在使6位的氫更易與羥基脫水失去）形成雙鍵使m/z 210的碎片無(wú)法失去，在此過(guò)程中母核可能發(fā)生構(gòu)型翻轉(zhuǎn)，因此產(chǎn)生多種立體結(jié)構(gòu)，5 個(gè)雜質(zhì)的具體構(gòu)型無(wú)法確定。他克莫司在酸降解條件下主要產(chǎn)生這些雜質(zhì)，發(fā)酵過(guò)程工藝中以及高溫濕法降解條件下也產(chǎn)生雜質(zhì)31。

（4）特征碎片(失去)210上的修飾

他克莫司歸屬大環(huán)內(nèi)酯類，可以失去m/z 111和m/z 210的特征碎片，產(chǎn)生相應(yīng)的特征碎片離子，觀察有關(guān)物質(zhì)17、27 二級(jí)質(zhì)譜特征碎片（圖14）發(fā)現(xiàn)其可以產(chǎn)生［（P-111-210）Na］+、［（P-111）Na］+、［（P-210）Na］+的系列特征碎片，［（P-111-210）Na］+、［（P-210）Na］+的系列特征碎片與他克莫司的特征碎片相一致，但［（P-111）Na］+系列碎片和他克莫司的特征碎片相差質(zhì)荷比恰為母離子相差的質(zhì)荷比，故推測(cè)結(jié)構(gòu)的改變位置位于210部分。

有關(guān)物質(zhì)17 ESI+-Q-TOF/MS測(cè)得其［M+Na］+準(zhǔn)確質(zhì)荷比為812.457 7，與離子式C43H67NO12Na+相應(yīng)，質(zhì)荷比比他克莫司少14對(duì)應(yīng)CH2，觀察其二級(jí)質(zhì)譜特征碎片可以發(fā)現(xiàn)它與［（P-111-210）Na］+、［（P-210）Na］+相關(guān)的碎片與他克莫司的一致，但［（P-111）Na］+相關(guān)碎片均比他克莫司的對(duì)應(yīng)少14對(duì)應(yīng)CH2，故推測(cè)有關(guān)物質(zhì)17為他克莫司210結(jié)構(gòu)部分六元環(huán)上甲氧基甲基丟失。他克莫司在高溫條件下以及發(fā)酵工藝中主要產(chǎn)生此雜質(zhì)。

Figure 13 Q-TOF/MS spectrum of RS 30,31,32,33,34[M+Na]+ion and their formation reaction

Figure 14 Q-TOF/MS spectrum of RS 17,27[M+Na]+ion and their formation mechanism

有關(guān)物質(zhì)27 ESI+-Q-TOF/MS 測(cè)得其［M+Na］+準(zhǔn)確質(zhì)荷比為824.459 2，與離子式C44H67NO12Na+相應(yīng)，質(zhì)荷比比他克莫司少2 對(duì)應(yīng)H2，觀察其二級(jí)質(zhì)譜特征碎片可以發(fā)現(xiàn)它與［（P-111-210）Na］+、［（P-210）Na］+相關(guān)的碎片與他克莫司的一致，但［（P-111）Na］+相關(guān)碎片均比他克莫司的對(duì)應(yīng)少2 對(duì)應(yīng)H2，故推測(cè)有關(guān)物質(zhì)27 為他克莫司在高溫條件下210 結(jié)構(gòu)部分六元環(huán)羥基被氧化為羰基。

（5）特征性碎片之外的修飾

觀察有關(guān)物質(zhì)10、11、14、29、35二級(jí)質(zhì)譜特征碎片，發(fā)現(xiàn)其可以產(chǎn)生與［（P-111-210）Na］+、［（P-111）Na］+、［（P-210）Na］+相關(guān)的系列特征碎片，但這些特征碎片與他克莫司的特征碎片相差質(zhì)荷比恰為母離子相差的質(zhì)荷比，故推測(cè)結(jié)構(gòu)的改變位置位于111和210結(jié)構(gòu)部分之外（圖15）。

Figure 15 Q-TOF/MS spectrum of RS 10,11,14,29,35[M+Na]+ion and their formation mechanism

有關(guān)物質(zhì)10 ESI+-Q-TOF/MS測(cè)得其［M+Na］+準(zhǔn)確質(zhì)荷比為812.459 2，與離子式C43H67NO12Na+相應(yīng)，質(zhì)荷比比他克莫司少14 對(duì)應(yīng)CH2，其所有特征性碎片均比他克莫司的對(duì)應(yīng)少14，與文獻(xiàn)已知雜質(zhì)比較，又其保留偏弱，故推測(cè)有關(guān)物質(zhì)10為他克莫司異構(gòu)體Ⅱ在高溫條件下失去14位的氧甲基變?yōu)榱u基。

有關(guān)物質(zhì)11 ESI+-Q-TOF/MS測(cè)得其［M+Na］+準(zhǔn)確質(zhì)荷比為842.470 0，與離子式C44H69NO13Na+相應(yīng)，質(zhì)荷比比他克莫司多16 對(duì)應(yīng)O，其所有特征性碎片均比他克莫司的對(duì)應(yīng)多16，故推測(cè)為他克莫司在高溫條件下8 位丙烯基的雙鍵被氧化為環(huán)氧基。

有關(guān)物質(zhì)14 ESI+-Q-TOF/MS測(cè)得其［M+Na］+準(zhǔn)確質(zhì)荷比為872.515 8，與離子式C46H75NO13Na+相應(yīng)，質(zhì)荷比比他克莫司多46 對(duì)應(yīng)C2H6O，其主要特征碎片m/z 551.283 6（C27H44O10Na+）對(duì)應(yīng)［（P-111-210）Na］+、m/z 761.445 3（C40H66O12Na+）對(duì)應(yīng)［（P-111）Na］+、m/z 662.354 7（C33H53NO11Na+）對(duì)應(yīng)［（P-210）Na］+相關(guān)的的特征碎片均對(duì)應(yīng)比他克莫司多46，保留較弱，故推測(cè)為他克莫司異構(gòu)體Ⅱ的11 位上去乙基同時(shí)8 位的丙烯基雙鍵被氧化為羥基，為發(fā)酵工藝中產(chǎn)生。

有關(guān)物質(zhì)29 ESI+-Q-TOF/MS測(cè)得其［M+Na］+準(zhǔn)確質(zhì)荷比為810.479 1，與離子式C44H69NO11Na+相應(yīng)，質(zhì)荷比比他克莫司少16 對(duì)應(yīng)O，其所有特征性碎片均比他克莫司的對(duì)應(yīng)少16，推測(cè)為他克莫司14位甲氧基變?yōu)榧谆?，為發(fā)酵工藝中產(chǎn)生。

有關(guān)物質(zhì)35 ESI+-Q-TOF/MS測(cè)得其［M+Na］+準(zhǔn)確質(zhì)荷比為824.459 0，與離子式C44H67NO12Na+相應(yīng)，質(zhì)荷比比他克莫司少2 對(duì)應(yīng)H2，其所有特征性碎片均比他克莫司的對(duì)應(yīng)少2，推測(cè)為他克莫司在高溫條件下12、13位脫氫生成雙鍵。

（6）他克莫司立體異構(gòu)體

有關(guān)物質(zhì)22 ESI+-Q-TOF/MS測(cè)得其［M+Na］+準(zhǔn)確質(zhì)荷比為826.473 7，與離子式C44H69NO12Na+相應(yīng)，質(zhì)荷比、特征碎片離子（圖16）以及離子式與他克莫司完全相同，為他克莫司發(fā)酵工藝中產(chǎn)生，根據(jù)其相對(duì)保留時(shí)間推測(cè)為他克莫司異構(gòu)體Ⅱ8位丙烯基發(fā)生了異構(gòu)化。

Figure 16 Q-TOF/MS spectrum of RS 22[M+Na]+ion

（7）其 他

有關(guān)物質(zhì)3 ESI+-Q-TOF/MS 測(cè)得其［M+Na］+準(zhǔn)確質(zhì)荷比為826.473 1，與離子式C44H69NO12Na+相應(yīng)，質(zhì)荷比以及離子式與他克莫司完全相同，為他克莫司發(fā)酵工藝中產(chǎn)生，觀察其二級(jí)質(zhì)譜特征碎片（圖17），782.481 4（C43H69NO10Na+）對(duì)應(yīng)［（PCO2）Na］+、738.494 3（C42H69NO8Na+）對(duì) 應(yīng)［（P-2CO2）Na］+可 以 連 續(xù) 失 去 兩 個(gè) CO2，616.309 7（C31H47NO10Na+）對(duì)應(yīng)［（P-210）Na］+，可以失去他克莫司特征性失去的碎片210，572.320 9（C30H47NO8Na+）對(duì)應(yīng)［（P-210-CO2）Na］+，528.330 8（C29H47NO6Na+）對(duì)應(yīng)［（P-210-2CO2）Na］+，有關(guān)物質(zhì) 3 在失去210的碎片后可以繼續(xù)失去兩分子CO2，故可知有關(guān)物質(zhì)3 結(jié)構(gòu)中存在兩處羧基或可以生成羧基的內(nèi)酯結(jié)構(gòu)［12］，又有關(guān)物質(zhì)3 保留比較靠前，在他克莫司堿降解條件下或者發(fā)酵過(guò)程中存在，推測(cè)與TLC記錄的雜質(zhì)他克莫司羥基酸有著類似結(jié)構(gòu)［11］，故可以先脫掉酯鍵水解后哌啶環(huán)上的羧基又可以繼續(xù)脫掉19位羧基繼而再失去1分子CO2。

有關(guān)物質(zhì)24 ESI+-Q-TOF/MS 測(cè)得其［M+Na］+準(zhǔn)確質(zhì)荷比為826.474 9，與離子式C44H69NO12Na+相應(yīng)，其二級(jí)質(zhì)譜特征碎片如圖17，有關(guān)物質(zhì)24可以產(chǎn)生m/z 653.404 5、m/z 635.395 5、m/z 625.408 9、m/z 607.400 0等有P-111相關(guān)的碎片，與P-210相關(guān)的碎片沒(méi)有或峰度很低，但存在m/z 499.266 7（C27H40O7）、427.281 9（C25H40O4），猜測(cè)生成m/z 210碎片斷鍵處存在結(jié)構(gòu)的改變，又根據(jù)其P-111 之外的碎片離子以及文獻(xiàn)已知雜質(zhì)，推測(cè)有關(guān)物質(zhì)24 是他克莫司在高溫條件下內(nèi)酯處發(fā)生了重排，內(nèi)酯處羥基由3位異位到5位。

有關(guān)物質(zhì)9、16、28 有關(guān)物質(zhì)9、16、28均為他克莫司在光照條件下產(chǎn)生，ESI+-Q-TOF/MS 測(cè)得其［M+Na］+準(zhǔn)確質(zhì)荷比均為 826.475 3，與離子式C44H69NO12Na+相應(yīng)，其二級(jí)質(zhì)譜特征碎片（圖17），可以產(chǎn)生m/z 616.309 3（C31H47NO10Na+）對(duì)應(yīng)［（P-210）Na］+的特征碎片，碎片信息顯示沒(méi)有失去與哌啶環(huán)相關(guān)的碎片，Q-TOF 生成分子式更是顯示所有的特征碎片均含有N 原子，故推測(cè)在光照條件下，他克莫司酰胺鍵處發(fā)生了一些結(jié)構(gòu)的改變從而使酰胺鍵不易斷裂。有關(guān)物質(zhì)9、16、28 與他克莫司分子式以及相對(duì)分子質(zhì)量完全一致，又結(jié)合文獻(xiàn)已知雜質(zhì)，得出酰胺鍵處結(jié)構(gòu)重排為內(nèi)酰胺，從而使酰胺鍵處變得很穩(wěn)定不易開裂。在這個(gè)過(guò)程中母核可能存在結(jié)構(gòu)翻轉(zhuǎn)，故有關(guān)物質(zhì)9、16、28保留時(shí)間不同。

Figure 17 Q-TOF/MS spectrum of RS 3,24,9,16,28[M+Na]+ion

4 討 論

在建立的揮發(fā)性流動(dòng)相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件下，他克莫司與各有關(guān)物質(zhì)得到了有效的分離，共檢測(cè)到35 個(gè)有關(guān)物質(zhì)；其中2 個(gè)為他克莫司的互變異構(gòu)體（美國(guó)藥典規(guī)定為他克莫司的有效成分），3 個(gè)已知雜質(zhì)。對(duì)這些有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，對(duì)發(fā)酵工藝質(zhì)量控制、評(píng)估藥物內(nèi)在穩(wěn)定性及儲(chǔ)存條件具有一定意義［13］。

他克莫司有關(guān)物質(zhì)的產(chǎn)生途徑見(jiàn)圖18。他克莫司在發(fā)酵工藝中產(chǎn)生了10 個(gè)有關(guān)物質(zhì)（有關(guān)物質(zhì)3、14、17、21、22、23、25、26、29、31）；原料藥中檢測(cè)到1個(gè)有關(guān)物質(zhì)21（他克莫司異構(gòu)體Ⅱ），含量未超過(guò)《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的限度。

Figure 18 Generation of main RSs of tacrolimus

強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)表明，他克莫司在酸堿氧化降解等含有水的溶液中，異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化率增高，同時(shí)在酸堿氧化加熱的條件下易發(fā)生酯鍵之間的斷裂與半縮醛結(jié)構(gòu)的開環(huán)重排（有關(guān)物質(zhì)1、2、4、5、8、12、13、19、20）；他克莫司在溶液狀態(tài)時(shí)在光照及高溫條件下不穩(wěn)定，在光照條件下較易產(chǎn)生重排（有關(guān)物質(zhì)9、16、28），在高溫條件下較易發(fā)生去甲基（有關(guān)物質(zhì)17）支鏈氧化（有關(guān)物質(zhì)27）以及脫氫脫水反應(yīng)（有關(guān)物質(zhì)31、35）。從雜質(zhì)解析結(jié)果可知，無(wú)論是發(fā)酵過(guò)程還是外加條件的降解，他克莫司內(nèi)酯以及19 位半縮醛結(jié)構(gòu)處活性較強(qiáng)，較易發(fā)生結(jié)構(gòu)的改變，他克莫司需避免潮濕，在密封干燥處保存。