金關(guān)片鎮(zhèn)痛抗炎作用的實驗研究

劉彥博　吳啟富等

【摘 要】目的：觀察金關(guān)片的鎮(zhèn)痛抗炎作用。方法：采用大鼠輻射熱刺激實驗、小鼠熱板法實驗、小鼠醋酸扭體實驗來觀察金關(guān)片的鎮(zhèn)痛作用，采用小鼠毛細血管通透性實驗、小鼠白細胞游走實驗、角叉菜膠致小鼠足腫脹實驗、小鼠棉球肉芽腫實驗、大鼠巴豆性氣囊腫實驗、大鼠胸膜炎實驗觀察金關(guān)片的抗炎作用，采用小鼠腎上腺質(zhì)量和維生素C含量測定金關(guān)片對腎上腺皮脂功能的影響。結(jié)果：金關(guān)片高、低劑量組均能提高大鼠輻射熱刺激痛閾值，提高小鼠熱板法痛閾值，抑制醋酸致小鼠扭體反應(yīng)，抑制小鼠腹腔毛細血管通透性增高，抑制小鼠白細胞游走，減輕角叉菜膠致小鼠足腫脹的程度，抑制小鼠棉球肉芽腫的形成，抑制大鼠巴豆性氣囊腫的形成，減少大鼠胸膜腔中白細胞的數(shù)量。金關(guān)片組大鼠腎上腺內(nèi)維生素C含量明顯低于空白組（P < 0.05或P < 0.01）。結(jié)論：金關(guān)片具有良好的鎮(zhèn)痛抗炎作用，且與增強腎上腺皮質(zhì)功能有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 金關(guān)片；鎮(zhèn)痛；抗炎；大鼠；小鼠

金關(guān)片在臨床主要用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎等疾病，效果顯著。本實驗從動物實驗角度對金關(guān)片的鎮(zhèn)痛抗炎作用進行藥效學(xué)評價，為金關(guān)片的臨床運用提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 實驗資料

1.1 實驗動物 健康昆明小鼠，SPF級，雄性，體質(zhì)量20～22 g，合格證號SCXK（粵）2012-A046SD；

大鼠，SPF級，雄性，體質(zhì)量180～200 g，合格證號SCXK（粵）2012-A051。由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 藥品及試劑 金關(guān)片（藥物組成：雷公藤、細辛、桂枝、秦艽、桑枝、黃芪、山藥、茯苓、薏苡仁、制附子、淫羊藿、枸杞子、黃精、鹿角霜、川續(xù)斷、牛膝、雞血藤、丹參。雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號Z20054153）；醋酸潑尼松龍（上海醫(yī)藥集團有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號H31020771）；布洛芬（上海雷允上藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號08020219）；吲哚美辛腸溶片（江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號H32021431）；冰醋酸（廣東東華化學(xué)廠有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號20071225）；二甲苯（廣東東華化學(xué)廠有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號20070623）；伊文思蘭（美國Amresco公司生產(chǎn)）；角叉菜膠（美國Sigma公司生產(chǎn)）。

1.3 儀 器 HP8453紫外-可見分光光度計（美國惠普公司生產(chǎn)）；VT-1300U超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司生產(chǎn)）；950FS動物血球分析儀（美國Drew scientific公司生產(chǎn)）；YLS-7B足趾容積測量儀（山東省科學(xué)院藥物研究所提供）；Metler Toledo P1303電子分析天平（上海梅特勒—特利多有限公司生產(chǎn)）；恒溫培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器公司生產(chǎn)）；OLYMPUS BH-2熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司生產(chǎn)）；LEICA RM2135型切片機（德國LEICA公司生產(chǎn)）；XZC-ZB 型自控?zé)岚鍍x（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院制造）；甩尾痛覺測試儀（美國ITC公司生產(chǎn)）。

2 研究方法

2.1 鎮(zhèn)痛作用

2.1.1 大鼠輻射熱刺激實驗[1] SD大鼠48只，隨機分為4組，即模型組、布洛芬組（0.03 g·kg-1）

和金關(guān)片高、低劑量組（1.0 g·kg-1、0.5 g·kg-1），

每組12只。各組大鼠灌胃0.5 mL相應(yīng)受試藥物，模型組給予等容積生理鹽水。經(jīng)輻射熱儀照射大鼠尾部致痛，以甩尾作為疼痛反應(yīng)指標(biāo)。將大鼠分別置于特制的固定圓筒內(nèi)，鼠尾自然下垂，大鼠稍經(jīng)訓(xùn)練即能保持安靜以備實驗。測痛時漏斗外口緊貼鼠尾，用電子秒表記錄從照射開始至出現(xiàn)甩尾的時間，作為痛閾值。連測2 次（間隔30 s），取平均值作為基礎(chǔ)痛閾值。選痛閾5 s左右的大鼠供實驗用，< 3 s或 > 10 s表示動物反應(yīng)過敏或遲鈍， 舍棄不用。給藥后1 h測定痛閾值，連測2次。測試中，若照射12.5 s仍不甩尾時，立即中斷照射，以免局部燙傷，并以12.5 s計。

2.1.2 小鼠熱板法實驗[2] 昆明種小鼠48只，隨機分為4組，即模型組、布洛芬組（0.04 g·kg-1）和金關(guān)片高、低劑量組（1.2 g·kg-1、0.6 g·kg-1），每組12只。各組動物灌胃0.5 mL相應(yīng)受試藥物，模型組給予等容積生理鹽水。以小鼠舔后足為疼痛反應(yīng)指標(biāo)測定小鼠痛閾值（即小鼠放入熱板測痛儀內(nèi)到出現(xiàn)舔后足反應(yīng)的時間）。選擇痛閾值在5～13 s

之內(nèi)的小鼠。實驗前測定各小鼠痛閾值2次（間隔30 s），取平均值為其基礎(chǔ)痛閾值。給藥后1 h測定各小鼠的痛閾值，超過60 s者以60 s計。

2.1.3 小鼠醋酸扭體實驗[3] 昆明種小鼠48只，隨機分為4組，即模型組、吲哚美辛組（0.01 g·kg-1）和金關(guān)片高、低劑量組（1.2 g·kg-1、0.6 g·kg-1），每組12只。各組動物灌胃0.5 mL相應(yīng)受試藥物，模型組給予等容積生理鹽水，連續(xù)灌胃給藥5 d。于末次給藥后30 min，每只小鼠腹腔注射質(zhì)量濃度0.6%的醋酸0.1 mL·（10 g）-1，記錄注射后20 min

內(nèi)各鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)的次數(shù)。

2.2 抗炎作用

2.2.1 小鼠腹腔毛細血管通透性實驗[4] 昆明種小鼠48只，隨機分為4組，即模型組、強的松組（0.002 g·kg-1）和金關(guān)片高、低劑量組（1.2 g·kg-1、

0.6 g·kg-1），每組12只。每天各組動物灌胃0.5 mL

相應(yīng)受試藥物，模型組給予等容積生理鹽水，連續(xù)灌胃給藥5 d。末次給藥后30 min，各小鼠尾靜脈注射質(zhì)量濃度0.5%的伊文思蘭溶液0.1 mL·

（10 g）-1，隨即腹腔注射質(zhì)量濃度0.6%的醋酸溶液0.1 mL·（10 g）-1，20 min后脫頸處死，剪開腹部皮膚肌肉，用6 mL生理鹽水分3次洗滌腹腔，吸管吸出洗滌液，合并后加生理鹽水至10 mL，置3 000 r·min-1離心機內(nèi)離心15 min；取上清液于590 nm比色測定OD值。

2.2.2 小鼠梭甲基纖維素囊中白細胞游出實驗[5] 昆明種小鼠48只，隨機分為4組，即模型組、吲哚美辛組（0.01 g·kg-1）和金關(guān)片高、低劑量組

（1.2 g·kg-1、0.6 g·kg-1），每組12只。每天各組動物灌胃0.5 mL相應(yīng)受試藥物，模型組給予等容積生理鹽水。各組給藥3 d后在無菌操作下向小鼠背部皮下注入空氣1 mL，形成一個近圓形氣囊，次日向囊內(nèi)注入質(zhì)量濃度1.5%的梭甲基纖維素鈉溶液1 mL致炎。于致炎后8 h從囊內(nèi)吸取液體20 μL，

加入到生理鹽水0.4 mL中，混勻，用微量移液器取10 μL作白細胞計數(shù)，以104·mL-1表示。

2.2.3 角叉菜膠致小鼠足腫脹實驗[6] 昆明種小鼠48只，隨機分為4組，即模型組、吲哚美辛組（0.01 g·kg-1）和金關(guān)片高、低劑量組（1.2 g·kg-1、

0.6 g·kg-1），每組12只。每天各組動物灌胃0.5 mL

相應(yīng)受試藥物，模型組給予等容積生理鹽水，連續(xù)灌胃給藥5 d。各組末次給藥l h后于小鼠右側(cè)足掌心皮下注射質(zhì)量濃度1%角叉菜膠每只30 μL，4 h

后沿踝關(guān)節(jié)剪下左右兩側(cè)后足，精密稱質(zhì)量（mg），以兩側(cè)足質(zhì)量差為腫脹度。

2.2.4 小鼠棉球肉芽腫實驗[7] 昆明種小鼠48只，隨機分為4組，即模型組、吲哚美辛組（0.01 g·kg-1）

和金關(guān)片高、低劑量組（1.2 g·kg-1、0.6 g·kg-1），每組12只。每天各組動物灌胃0.5 mL的相應(yīng)受試藥物，模型組給予等容積生理鹽水，連續(xù)灌胃給藥5 d。乙醚麻醉，在各鼠的背部正中央去毛并用質(zhì)量濃度75%的乙醇消毒，然后用手術(shù)剪刀開0.5 cm

長的小口，用眼科鑷子將已精密稱質(zhì)量為10 mg的滅菌棉球（稱質(zhì)量后在質(zhì)量濃度75%的乙醇中浸泡消毒并干燥）從小切口植入皮下，并在切口上撒適量的青霉素以防止傷口感染，之后用手術(shù)針縫合小鼠皮膚。然后隨機分成4組，給藥同上述實驗，從手術(shù)當(dāng)天開始，灌胃給藥每日1次，連續(xù)5 d。末次給藥后5 h脫頸處死小鼠，用剪刀和鑷子打開原切口，將棉球連同周圍結(jié)締增生組織一起取出，剔除脂肪組織，放入烘箱中60 ℃烘干8 h，稱質(zhì)量（mg）。將稱得的質(zhì)量減去棉球原質(zhì)量即得肉芽腫的質(zhì)量。

2.2.5 大鼠巴豆油性氣囊腫實驗 SD大鼠48只，隨機分為4組，即模型組、吲哚美辛組（0.01 g·kg-1）

和金關(guān)片高、低劑量組（0.6 g·kg-1、1.2 g·kg-1），每組12只。大鼠背部皮下注射20 mL空氣，立即向氣囊內(nèi)注入質(zhì)量濃度1%巴豆油l mL致炎，24 h后抽出空氣。致炎后每天各組動物灌胃0.5 mL相應(yīng)受試藥物，模型組給予等容積生理鹽水，連續(xù)灌胃給藥5 d。末次給藥8 h后處死大鼠，剝離囊壁肉芽腫，并用生理鹽水反復(fù)漂洗干凈，在60 ℃烘箱中干燥8 h，用分析天平精密稱質(zhì)量（mg）。

2.2.6 大鼠胸膜炎實驗 SD大鼠48只，隨機分為4組，即模型組、吲哚美辛組（0.01 g·kg-1）和金關(guān)片高、低劑量組（0.6 g·kg-1、1.2 g·kg-1），

每組12只。預(yù)先給予各組動物灌胃0.5 mL相應(yīng)受試藥物，模型組給予等容積生理鹽水。2 d后向胸膜腔內(nèi)注射角叉菜膠溶液（0.2 mL，10 mg·mL-1）致炎；致炎4 h 后將其處死，打開胸腔，吸取胸腔滲出液，測定白細胞數(shù)。

2.3 小鼠腎上腺質(zhì)量和維生素C含量測定實驗[8]

昆明種小鼠36只，隨機分為3組，即空白對照組，金關(guān)片高、低劑量組（1.2 g·kg-1，0.6 g·kg-1），

每組12只。每天各組動物灌胃0.5 mL相應(yīng)受試藥物，模型組給予等容積生理鹽水，連續(xù)灌胃給藥5 d。末次給藥后快速處死小鼠，取其腎上腺精密稱質(zhì)量，并用維生素C試劑盒測定每個腎上腺中維生素C的含量。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，組內(nèi)前后比較采用配對t檢驗，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組對大鼠輻射熱刺痛閾值影響 金關(guān)片低、高劑量及布洛芬能提高大鼠輻射熱刺激閾值

（P < 0.05），提示金關(guān)片和布洛芬都能抑制大鼠輻射熱刺所致的疼痛反應(yīng)，見表1。

3.2 各組對小鼠熱板法痛閾值的影響 金關(guān)片低、高劑量及布洛芬能提高小鼠熱板法痛閾值（P < 0.05），

提示金關(guān)片和布洛芬都能抑制小鼠熱板法痛閾值所致的疼痛反應(yīng)，見表2。

3.3 各組對醋酸所致小鼠扭體次數(shù)的影響 金關(guān)片低、高劑量組及布洛芬組的小鼠在20 min內(nèi)扭體次數(shù)平均比空白對照組明顯減少（P < 0.05），提示金關(guān)片和布洛芬都能抑制小鼠醋酸刺激所致的疼痛反應(yīng)，見表3。

3.4 各組對小鼠腹腔毛細血管通透性的影響 與模型組比較，金關(guān)片低、高劑量及強的松組的OD值均顯著減少（P < 0.05），提示金關(guān)片和強的松對冰醋酸所致小鼠毛細血管通透性的增高有明顯抑制作用，見表4。

3.5 各組對小鼠梭甲基纖維素囊中白細胞游出數(shù)目的影響 金關(guān)片能抑制小鼠梭甲基纖維素囊中白細胞的游出，降低囊中白細胞的數(shù)目，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。說明金關(guān)片能抑制炎癥中期白細胞的游走，見表5。

3.6 各組對角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響 金關(guān)片對角叉菜膠致小鼠足腫脹有顯著的拮抗作用，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），見表6。

3.7 各組對小鼠棉球肉芽腫形成的影響 金關(guān)片能抑制小鼠棉球肉芽腫的形成，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。說明金關(guān)片對炎癥晚期的纖維組織增生有抑制作用，見表7。

3.8 各組對大鼠巴豆油性氣囊腫形成的影響 與模型組比較，金關(guān)片能抑制大鼠巴豆油性氣囊腫形成，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。說明金關(guān)片對炎癥晚期的結(jié)締組織增生有一定的抑制作用，見表8。

3.9 各組對胸膜炎大鼠胸腔滲出液中白細胞數(shù)量的影響 與模型組比較， 致炎前預(yù)先給予吲哚美辛或金關(guān)片的各組大鼠胸腔滲出液中的白細胞數(shù)量明顯減少（P < 0.01），見表9。

3.10 各組對正常小鼠腎上腺質(zhì)量和維生素C含量的影響 金關(guān)片對小鼠腎上腺重量沒有明顯的影響，與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。金關(guān)片高、低劑量組大鼠腎上腺中維生素C的含量低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），見表10。

4 討 論

疼痛與炎癥是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎等疾病中最常見的臨床癥狀，因此，鎮(zhèn)痛與抗炎成為最主要的對癥治療手段。金關(guān)片方中雷公藤祛風(fēng)除濕，活血通絡(luò)，消腫止痛；細辛可治百節(jié)拘攣，風(fēng)濕痹痛。兩藥同用，藥雄力峻，循經(jīng)入絡(luò)，直達病所，搜剔頑痰，以袪邪，共為君藥。桂枝、秦艽、桑枝3種藥均為治療痹證常用之品，3種藥寒熱并用，意在宣通透達，解寒熱錯雜之癥，助君藥以剔逐痼結(jié)之邪，同為臣藥。黃芪、山藥、茯苓、薏苡仁以益氣健脾，利水化濕；制附子、淫羊藿、枸杞子、黃精、鹿角霜、川續(xù)斷、牛膝等陰陽共進，補益肝腎，強筋健骨，還可增強對雷公藤、細辛之毒性的耐受力，防其毒傷正之弊，共為佐藥。雞血藤、丹參顧及氣血，活血通絡(luò)，祛痰生新，共為使藥。諸藥配合，共奏止痛祛寒、活血通絡(luò)、補益肝腎之效。現(xiàn)代藥理研究表明，雷公藤具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[9]，細辛、桑枝、秦艽、桂枝、附子、薏苡仁、川牛膝具有明顯的鎮(zhèn)痛抗炎作用[10-14]，雞血藤、丹參具有抗炎、改善微循環(huán)的作用[15]，淫羊藿具有促成骨、抗炎癥、抗腫瘤等作用[16]。

本項研究采用經(jīng)典的疼痛、炎癥模型，重點觀察了金關(guān)片的抗炎和鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果顯示，金關(guān)片具有較強的鎮(zhèn)痛抗炎作用，能顯著減少醋酸所致的小鼠扭體次數(shù)，提高實驗動物疼痛閾值；同時，能夠顯著地抑制醋酸誘導(dǎo)的小鼠腹腔毛細血管通透性，抑制炎癥中期白細胞游走，拮抗角叉菜膠所致的足腫脹，抑制小鼠棉球肉芽腫的形成，抑制大鼠巴豆油性氣囊腫的形成，抑制大鼠胸膜炎癥，對抗以毛細血管擴張、通透性增加、滲出性水腫為主的急性炎癥反應(yīng)。此外研究還發(fā)現(xiàn)，金關(guān)片高、低劑量組大鼠腎上腺中維生素C含量明顯低于模型組，維生素C是合成體內(nèi)類激素的前體，其含量降低提示腎上腺皮質(zhì)活動增強。因此提示金關(guān)片抗炎鎮(zhèn)痛作用，其作用機制可能與增強腎上腺皮質(zhì)腺功能有關(guān)。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎主要表現(xiàn)多為關(guān)節(jié)滑膜炎性細胞浸潤、血管翳形成、軟骨及骨組織侵蝕等病理變化，今后設(shè)想重點研究金關(guān)片對關(guān)節(jié)炎模型鼠的滑膜、軟骨及骨的保護作用及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用。

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