AG490及5-Aza對(duì)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響及分子機(jī)制*

羅杰 廖劍雄 劉維佳 余倩 劉琳

(1.貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550002；2.貴州省人民醫(yī)院急診科，貴州 貴陽(yáng) 550002；3.貴州省人民醫(yī)院院辦，貴州 貴陽(yáng) 550002；4.貴州省人民醫(yī)院呼吸科，貴州 貴陽(yáng) 550002)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是以肺動(dòng)脈壓力和肺血管阻力進(jìn)行性增高為特征的心肺血管疾病。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)異常增殖導(dǎo)致的肺血管重構(gòu)是PAH重要的病理學(xué)改變[1]。血小板源性生長(zhǎng)因子(Platelet derived growth factor，PDGF)-BB是一種促血管生成因子，可誘導(dǎo)PASMCs增殖[2]。IL-6是一種多效細(xì)胞因子，在PAH患者的血清和肺組織中表達(dá)增高，并且在促血管重構(gòu)方面發(fā)揮重要作用，是PAH的生存率預(yù)測(cè)因子[3-4]。JAK2為Janus激酶家族成員，是一種非受體酪氨酸激酶，參與肺血管重塑過(guò)程[5]。GATA6在PASMCs的增殖和分化中發(fā)揮調(diào)控作用，GATA6 啟動(dòng)子CpG 島甲基化可導(dǎo)致 GATA6 失去對(duì)下游靶基因的調(diào)控，引起細(xì)胞增殖/凋亡異常[6]。然而，IL-6是否能夠通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)通路調(diào)節(jié)GATA6 啟動(dòng)子甲基化，進(jìn)而改變PASMCs的增殖或分化狀態(tài)，目前報(bào)道較少。本研究探討JAK2/STAT3通路抑制劑AG490、DNA甲基化抑制劑5-Aza對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)大鼠PASMCs增殖、JAK2/STAT3信號(hào)通路和GATA6基因表達(dá)變化的影響及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)雄性SD大鼠2只，體重250～300 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。大鼠的處理符合動(dòng)物倫理要求，并經(jīng)貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核同意。

1.1.2 主要試劑 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；青-鏈霉素、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF-BB)為美國(guó)Peprotech產(chǎn)品；AG490、5-Aza為美國(guó)MCE產(chǎn)品； CCK8試劑為日本Dojindo產(chǎn)品；JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3抗體為美國(guó)CST產(chǎn)品；GATA6抗體為武漢三鷹產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國(guó)Thermo產(chǎn)品；熒光Mix為日本TaKaRa產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱、超微量紫外可見分光光度儀、酶標(biāo)檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；電泳儀、熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；臺(tái)式冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；凈工作臺(tái)(蘇凈安泰公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠PASMCs的培養(yǎng) 將大鼠麻醉后，取出心肺組織，分離肺動(dòng)脈并去除外膜結(jié)締組織，縱向剪開肺動(dòng)脈，刮除內(nèi)膜，將中膜剪成1 mm2細(xì)小組織塊，轉(zhuǎn)移至0.2%Ⅰ型膠原酶中，放入CO2培養(yǎng)箱，每20 min搖動(dòng)一次，大約消化2～3 h，1000 r/min離心5 min，棄上清，加入5 mL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，吹打混勻移入25 mm2培養(yǎng)瓶，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞80%融合時(shí)按1:2比例傳代，傳至3～10代可用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 AG490干預(yù)部分將PASMCs分為5組：對(duì)照組(含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基)；0μM組(30μg/L PDGF-BB孵育48h)；25μM組(30μg/L PDGF-BB +25μmol/L AG490孵育48h)；50μM組(30ng/mL PDGF-BB +50μmol/L AG490孵育48h)；100μM組(30μg/L PDGF-BB +100μmol/L AG490孵育48h)。5-Aza干預(yù)部分將PASMCs分為5組：對(duì)照組(含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基)；0μM組(30μg/L PDGF-BB孵育48h)；1μM組(30μg/L PDGF-BB+1μmol/L5-Aza孵育48h)；3μM組(30μg/L PDGF-BB+3μmol/L 5-Aza孵育48h)；5μM組(30μg/L PDGF-BB+5μmol/L 5-Aza孵育48h)。

1.2.3 CCK8分別檢測(cè)AG490、5-Aza對(duì)PASMCs增殖的影響 將細(xì)胞按2×103/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁，加無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h同步化，棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，分別用30μg/L PDGF-BB+ AG490(0、5、10、25、50、75、100μmol/L)和30μg/L PDGF-BB +5-Aza(0、0.5、1、2、3、4、5μmol/L)處理細(xì)胞48h，棄培養(yǎng)液，每孔加入100μL培養(yǎng)液、10μL CCK8溶液，置于CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2h，用酶標(biāo)儀輕柔振蕩1min，測(cè)定在450nm處的吸光度，參照波長(zhǎng)為650nm，每組設(shè)6復(fù)孔、3空白孔。

1.2.4 RT-qPCR檢測(cè)IL-6、JAK2、STAT3和GATA6mRNA的表達(dá) Trizol法提取細(xì)胞總RNA；按ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；按TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ說(shuō)明書進(jìn)行qPCR，引物序列,見表1。

表1 引物序列表

1.2.5 Western blot檢測(cè)GATA6、p-JAK2及p-STAT3蛋白表達(dá)水平 裂解細(xì)胞提取蛋白，用BCA定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1h，分別加入GATA6(1∶1000)、STAT3(1∶1000)、p-STAT3 (1∶1000)、JAK2(1∶1000)、p-JAK2(1∶1000)、β-actin(1∶10000)抗體(一抗)4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后加二抗室溫孵育1h，洗膜后ECL發(fā)光液顯影，用Image J軟件分析條帶灰度值，以GATA6/β-actin、p-STAT3/STAT3、p-JAK2/JAK2的比值表示蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 AG490及5-Aza對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)PASMCs增殖的影響 CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，30μg/L PDGF-BB誘導(dǎo)48h后PASMCs增殖顯著(P<0.05)。與0μM組相比，不同濃度AG490和5-Aza干預(yù)48h后，均抑制了PDGF-BB對(duì)PASMCs的增殖作用，AG490及5-Aza各濃度間細(xì)胞OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分別為357.764和277.277，均P<0.01)(見圖1)。AG490的半數(shù)抑制濃度(IC50)為61.269μmol/L，5-Aza的IC50為3.507μmol/L。

圖1 AG490及5-Aza對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)PASMCs增殖的影響

2.2 AG490對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)PASMCs增殖中相關(guān)mRNA表達(dá)的影響 qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，0μM組IL-6、JAK2和STAT3mRNA水平升高(P<0.05)，GATA6 mRNA水平降低(P<0.05)。與0μM組相比，隨著AG490濃度的升高，IL-6、JAK2和STAT3mRNA的表達(dá)逐漸降低，而GATA6 mRNA的表達(dá)逐漸升高，各濃度間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表2。

表2 不同濃度AG490對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)PASMCs增殖中相關(guān)mRNA表達(dá)的影響

2.3 5-Aza對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)PASMCs增殖中相關(guān)mRNA表達(dá)的影響 qPCR結(jié)果顯示，與0μM組相比，1μM、3μM、5μM組中IL-6 mRNA顯著降低(P<0.05)，JAK2和STAT3 mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，3μM 和5μM 組中GATA6 mRNA水平顯著升高(P<0.05)，見表3。

表3 不同濃度5-Aza對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)PASMCs增殖中相關(guān)mRNA表達(dá)的影響

2.4 AG490對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)PASMCs增殖中GATA6、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)的影響 Western Blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，0μM組GATA6蛋白表達(dá)顯著降低，p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3水平顯著升高(P<0.05)。25μM、50μM和100μM組中GATA6水平較0μM組升高，而p-JAK2/JAK2水平較0μM組降低，50μM和100μM組中p-STAT3/STAT3水平較0μM組降低(P<0.05)，見圖2。

圖2 不同濃度AG490對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)PASMCs增殖中GATA6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平的影響

2.5 5-Aza對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)PASMCs增殖中GATA6、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)的影響 Western Blot結(jié)果顯示，與0μM組相比，1μM、3μM和5μM組中GATA6 、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)，而p-JAK2/JAK2水平降低(P<0.05)，各濃度組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

圖3 不同濃度5-Aza對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)PASMCs增殖中GATA6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平的影響

3 討論

肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞異常增殖介導(dǎo)的肺血管重構(gòu)是肺動(dòng)脈高壓病理過(guò)程的主要環(huán)節(jié)[7]。血小板源性生長(zhǎng)因子PDGF-BB是血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)最有效的促有絲分裂因子，還是PAH的化學(xué)誘導(dǎo)劑，在PASMCs增殖中起重要作用[8-9]。有研究表明，PDGF-BB可促進(jìn)IL-6基因的表達(dá)和PASMCs的增殖，在IL-6siRNA干擾作用下，PDGF-BB誘導(dǎo)的IL-6表達(dá)減少，可抑制PASMCs分裂。此外，PDGF受體拮抗劑可抑制PASMCs的增殖，改善肺血管重構(gòu)過(guò)程[10-11]。因此本研究采用30μg/L PDGF-BB孵育細(xì)胞48h，PASMCs增殖顯著，IL-6mRNA表達(dá)上升，提示IL-6可能參與PDGF-BB誘導(dǎo)PASMCs增殖過(guò)程。

細(xì)胞因子驅(qū)動(dòng)的炎癥過(guò)程在PAH的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其中IL-6被認(rèn)為是PAH發(fā)病機(jī)制中最重要的細(xì)胞因子，與PAH的病理過(guò)程密切相關(guān)[12-13]。低氧誘導(dǎo)的PASMCs，其炎癥介質(zhì)IL-6分泌增高，分泌的IL-6可進(jìn)一步促進(jìn)PASMCs增殖，以及引起肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化[14]。JAK2為Janus激酶家族成員參與PASMCs增殖調(diào)控，當(dāng)細(xì)胞因子IL-6與細(xì)胞表面受體結(jié)合后，JAK2會(huì)發(fā)生自磷酸化作用產(chǎn)生對(duì)接位點(diǎn)，使轉(zhuǎn)錄因子STAT3磷酸化形成二聚體，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中與特定啟動(dòng)子結(jié)合，從而轉(zhuǎn)錄與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因[15]。研究表明，阻滯JAK2活性可以抑制STAT3與CCNA2啟動(dòng)子的結(jié)合，從而抑制缺氧誘導(dǎo)的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖，減弱肺血管重塑[16]。AG490是JAK2特異性拮抗劑，能有效阻斷JAK2信號(hào)傳導(dǎo)途徑[17]，本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度AG490與PDGF-BB共同孵育細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)AG490可有效抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，且細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨AG490濃度增加而升高，呈現(xiàn)一定濃度依賴性，同時(shí)，IL-6、JAK2、STAT3的表達(dá)也受到抑制。提示PDGF-BB可能通過(guò)促進(jìn)IL-6的分泌增加，激活JAK2/STAT3信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)PASMCs增殖。

GATA6是唯一表達(dá)于VSMCs的 GATA家族轉(zhuǎn)錄因子，也是PASMCs的核內(nèi)抑制因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和維持細(xì)胞表型[18-19]。VSMCs存在收縮 (靜止)和合成 (增殖)兩種表型，當(dāng)外界因素發(fā)生變化，VSMCs可由收縮表型轉(zhuǎn)化為合成表型開始增殖[20]。GATA6在體內(nèi)外均對(duì)VSMCs具有較強(qiáng)的抗增殖、促分化作用，GATA6基因敲除可使VSMCs保持收縮表型的能力降低[21]。在損傷、有絲分裂素刺激下，GATA6可以參與細(xì)胞周期相關(guān)基因和平滑肌特異性基因的調(diào)節(jié)。平滑肌細(xì)胞特異性基因，如：平滑肌細(xì)胞肌球蛋白重鏈、肌動(dòng)蛋白、鈣調(diào)蛋白、粘著斑蛋白等與平滑肌細(xì)胞分化表型相關(guān)的蛋白，這些基因啟動(dòng)子上游均有GATA6的DNA結(jié)合位點(diǎn)，GATA6可以啟動(dòng)這些基因的轉(zhuǎn)錄，維持平滑肌細(xì)胞的分化表型，過(guò)表達(dá)GATA6可以誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)的停滯[22]。既往研究發(fā)現(xiàn)，IL-6能選擇性地誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子甲基化，伴隨靶基因的低表達(dá)。IL-6增加了與腫瘤抑制、黏附和凋亡抵抗相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化，下調(diào)了這些基因的表達(dá)[23]。在胰腺癌細(xì)胞增殖過(guò)程中，IL-6通過(guò)STAT3信號(hào)通路將甲基轉(zhuǎn)移酶-1(Dnmt1)集中到SOCS3啟動(dòng)子區(qū)使其甲基化抑制轉(zhuǎn)錄過(guò)程[24]。而GATA6啟動(dòng)子CpG島甲基化可導(dǎo)致GATA6失去對(duì)下游靶基因的調(diào)控，引起細(xì)胞增殖/凋亡異常。Dnmts是催化DNA甲基化的關(guān)鍵酶，5-azadeoxycytidine(5-Aza)是一種Dnmt1抑制劑[25]。本實(shí)驗(yàn)中30μg/L PDGF-BB孵育細(xì)胞48h后GATA6表達(dá)降低，而AG490或5-Aza與PDGF-BB共同孵育細(xì)胞后GATA6表達(dá)明顯增高，5-Aza可抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，提示IL-6能通過(guò)激活JAK2/STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)GATA6啟動(dòng)子甲基化，抑制GATA6基因的表達(dá)，使其失去對(duì)PASMCs的抗增殖作用。AG490和5-Aza可分別作用于JAK2/STAT3通路及GATA6啟動(dòng)子區(qū)來(lái)阻斷這一傳導(dǎo)過(guò)程。

4 結(jié)論

AG490及5-Aza可抑制 PDGF-BB對(duì)PASMCs的增殖作用，該作用可能與AG490阻斷JAK2/STAT3信號(hào)通路，抑制PDGF-BB誘導(dǎo)分泌的IL-6經(jīng)JAK2/STAT3通路入核調(diào)節(jié)GATA6基因啟動(dòng)子甲基化，使其發(fā)揮對(duì)PASMCs的抗增殖作用有關(guān)。