小擬南芥液泡膜H＋－PPase基因OpVP1的克隆、序列分析及表達(dá)

徐芳，趙云霞，魏艷玲，李超，孫黎，黃先忠

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832003）

鹽脅迫是導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)的主要非生物因素之一，土壤中過高濃度的Na＋會造成植物的生理干旱，擾亂細(xì)胞的離子平衡，導(dǎo)致膜功能失調(diào)和代謝活動的減弱，從而抑制生長并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［1］。植物細(xì)胞抵御Na＋毒害的主要策略有Na＋的外排和Na＋的區(qū)域化［2］。這2個(gè)過程分別由分布在質(zhì)膜和液泡膜上的Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白實(shí)現(xiàn)。已有研究表明，液泡膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在液泡膜H＋－ATPase和液泡膜H＋－PPase建立的跨液泡膜質(zhì)子梯度的驅(qū)動下，將細(xì)胞質(zhì)中過多的Na＋區(qū)域化到液泡內(nèi)，從而減輕了Na＋對細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的各類代謝酶的危害，同時(shí)降低了細(xì)胞滲透勢，進(jìn)而提高植物的耐鹽性和抗旱性［3－4］。

液泡膜H＋－PPase是一種廣泛存在于很多生物體內(nèi)的H＋轉(zhuǎn)運(yùn)酶。它只包含1條分子量約80kDa的多肽，結(jié)構(gòu)簡單，其底物為簡單的低價(jià)焦磷酸（PPi），含有1個(gè)高能磷酸酐鍵［5］。在植物對水分脅迫和鹽分脅迫的響應(yīng)中，H＋－PPase作為一種有效的質(zhì)子泵調(diào)節(jié)細(xì)胞的酸度，驅(qū)動各種離子在液泡內(nèi)的區(qū)隔化，扮演著重要的角色。液泡膜H＋轉(zhuǎn)運(yùn)無機(jī)焦磷酸酶水解2個(gè)無機(jī)磷（Pi）的同時(shí)，還能將H＋從細(xì)胞質(zhì)經(jīng)過液泡泵入膜內(nèi)，起到質(zhì)子泵的作用，即將PPi水解的自由能與質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相偶聯(lián)，形成質(zhì)子驅(qū)動力（△H＋），為離子和其它溶質(zhì)的次級轉(zhuǎn)運(yùn)提供動力［5］。在植物細(xì)胞中，H＋－PPase除了作為一種有效的質(zhì)子泵調(diào)節(jié)細(xì)胞的酸度，驅(qū)動各種離子在液泡內(nèi)的區(qū)隔化外，還可作為一種調(diào)節(jié)因子控制植物生長素的運(yùn)輸，在植物響應(yīng)逆境脅迫和調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的過程中可能起作用［6］。近年來，人們對植物耐鹽的分子機(jī)制的研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展。但是，植物的耐鹽性是一個(gè)復(fù)雜的問題，還存在很多的問題需要進(jìn)一步的闡明。所以，對植物耐鹽性的進(jìn)一步探索，還需從更多的鹽生植物著手，挖掘耐鹽相關(guān)基因，才能真正從細(xì)胞、組織和整體水平上闡明植物鹽脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為植物的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

小擬南芥為十字花科無苞芥屬早春短命植物，異種名是Arabidopsis pumila，現(xiàn)在的接受名是Olimarabidopsis pumila，是模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）的近緣種［7］。小擬南芥在新疆分布較為廣泛，適應(yīng)新疆特殊的干旱氣候，具有生活周期短、光合效率高、結(jié)實(shí)量大的特點(diǎn)［8］。近年來對小擬南芥耐鹽生物學(xué)特性進(jìn)行初步的研究，發(fā)現(xiàn)小擬南芥適應(yīng)于新疆特殊環(huán)境，具有耐受高濃度NaCl脅迫的特性［9，10］。小擬南芥是植物生物學(xué)研究較好的材料，可以利用它研究平行進(jìn)化的同源基因和進(jìn)化中產(chǎn)生的新基因。近年來，我們一直以小擬南芥為研究材料，克隆了Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因ApNHX1［10］，構(gòu)建了小擬南芥經(jīng)高鹽脅迫的入門cDNA文庫［11］。本研究通過同源克隆的方法試圖從小擬南芥克隆1個(gè)液泡膜H＋－PPase逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因cDNA全長序列，并利用一系列生物信息學(xué)軟件分析了該蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域、跨膜特性、系統(tǒng)進(jìn)化等，旨在為進(jìn)一步研究該基因的功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

新疆小擬南芥（Olimarabidopsis pumila）種子為本實(shí)驗(yàn)室保存，小擬南芥的室內(nèi)培養(yǎng)參照文獻(xiàn)［10］中的方法進(jìn)行。

大腸桿菌菌株 DH5α、質(zhì)粒pCAMBIA2300－CaMV35S由本實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒pMD18－T vector、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶、Taq酶、IPTG、X－gal、DEPC購自TaKaRa公司，SMARTTM RACE cDNA Amplificatin Kit購自Clontech公司，凝膠回收試劑盒購自Promega公司，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 新疆小擬南芥RNA的提取和cDNA的合成

小擬南芥根、莖、葉片、花和角果等組織總RNA的提取采用TIANGEN公司的RNA prep pure Plant Kit試劑盒（離心柱型），參照說明書提取。cDNA模板第一鏈的制備，根據(jù)Promega公司MMLV Reverse Transcriptase合成。

1.2.2 OpVP1基因核心片段的擴(kuò)增

根據(jù)NCBI上登錄的液泡膜H＋－PPase基因的保守序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增核心序列的1對引物：

P1：5′－GACCAGAGTGTTGTGGCTAA－3′；P2：5′－ATGTGGCGTAGTCAGGTT－3′。

以上面制備的葉片cDNA為模板，P1，P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

RT－PCR擴(kuò)增體系為20μL：cDNA 3μL，10×Ex Taq Buffer 2.0μL，2.5mmol／L dNTP Mixture 1.5μL，10μmol／L的上下游引物各0.5μL，Ex Taq（5U／μL）0.2μL。

擴(kuò)增條件：94℃2min后；94℃30s，56℃30 s，72℃2min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠回收試劑盒回收目的片段。將目的片段連接到pMD 18－T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆于LB培養(yǎng)基中過夜搖菌，小量提取質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒交由北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.3 OpVP1的3′RACE和5′RACE擴(kuò)增

根據(jù)OpVP1基因的核心片段序列，分別設(shè)計(jì)3′RACE和5′RACE引物各2個(gè)。

3′RACE引物OpVP－3－GSP1：5′－TTCGCAGGCAGTTCAACACCATC－3′；

OpVP－3－GSP2：5′－GATTCCTCCTGGTTGCC TTGTCA－3′。

5′RACE引物OpVP－5－GSP1：5′－CAGAGGTAACAGCACCAAGAACG－3′；

OpVP－5－GSP：5′－GTGCTGAATCCCTCAAC AGAGCC－3′。

RACE反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件均按照SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit說明書進(jìn)行。

1.2.4 OpVP1基因開放閱讀框（ORF）的擴(kuò)增

根據(jù)核心片段序列、3′RACE和5′RACE擴(kuò)增序列，拼接得到OpVP1基因全長cDNA序列，利用ORF Finder（www.ncbi.nlm.nih.gov／gorf／gorf.html）尋找ORF，根據(jù)最長的ORF設(shè)計(jì)1對引物：

Bam HⅠ－OpVP1－F：5′－CGGGATCCATGGTGGCGACAGCTTTACTACCGG－3′（下劃線代表Bam HⅠ酶切位點(diǎn)）；

XbaⅠ－OpVP1－R：5′－GCTCTAGATTAGAGGTACTTGAAAAGGATACC－3′（下劃線代表XbaⅠ酶切位點(diǎn)），用作OpVP1基因ORF的擴(kuò)增。

擴(kuò)增體系為20μL：cDNA 3μL，10×Ex Taq Buffer 2.0μL，2.5mmol／L dNTP Mixture 1.5 μL，10μmol／L的上下游引物各0.5μL，Ex Taq（5U／μL）0.2μL。

擴(kuò)增條件：94℃2min；94℃45s，58℃45s，72℃3min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。

目的片段的檢測和測序同1.2.2。這樣構(gòu)建了pMD 18－T：OpVP1載體。

1.2.5 生物信息學(xué)分析

蛋白理化性質(zhì)預(yù)測用ProtParam （http：／／www.expasy.ch／tools／protparam.html）分析；疏水性／親水性分析用ProtScale （http：／／expasy.org／tools／protscale.html）分析；跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測用TMHMM－2.0 （http：／／www.cbs.dut.dk／services／TMHMM－2.0／）；蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測使用Swiss－Model workspace （http：／／swissmodel.expasy.org／）進(jìn)行同源建模［12］，并用 Swiss－Pdb Viewer 4.1.0進(jìn)行可視化分析。

在 NCBI（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）中下載相關(guān)的VP蛋白序列，利用MEGA4.1（Molec－ular Evolutionary Genetics Analysis，version4.1）軟件進(jìn)行部分已知VP蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析，蛋白序列比對利用Clustal W程序進(jìn)行，進(jìn)化樹利用Neighbor－Joining方法構(gòu)建，其中進(jìn)行1000次Bootstrap分析以使得分枝的結(jié)果更可靠［13］。

1.2.6 OpVP1基因組織表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT－PCR）技術(shù)分析OpVP1在小擬南芥不同組織中的表達(dá)。

基因特異上游引物：5′－GCCTGGGACAACGCCAAGAAGTA－3′；

下游引物和5′－CACCGTGAGTGGCAAAGA A GGGA－3′。

內(nèi)參引物采用Actin2引物，分別為Actin2－F：5′－GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG－3′；Actin2－R：5′－AACGACCTTAATCTTCATGCTGC－3′擴(kuò)增。

qRT－PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照TaKaRa公司產(chǎn)品SYBR○RPremix Ex TaqTM（Perfect Real Time）的試劑說明書的方法進(jìn)行。PCR儀為羅氏Light Cycler○R480Real－Time PCR System 熒 光定量PCR儀，檢測每份樣品的OpVP1基因和Acitin2內(nèi)參基因Ct值，每份樣品3次重復(fù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用2－△Ct法進(jìn)行相對定量分析，先分別計(jì)算出每組的△Ct＝Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因，再根據(jù)△Ct求出2－△Ct以及標(biāo)準(zhǔn)誤。使用Microsoft Excel 2007軟件處理數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小擬南芥液泡膜H＋－PPase基因全長的克隆

以小擬南芥的葉片cDNA為模板，利用保守引物擴(kuò)增得到1條約為1600bp的核心片段（圖1－1）。將該片段克隆、測序，Blast X比對分析，發(fā)現(xiàn)該序列與擬南芥的AVP1（NM＿101437.4）氨基酸相似性為94%，表明該序列可能為小擬南芥質(zhì)子焦磷酸酶基因。通過3′RACE擴(kuò)增得到700bp的3′端cDNA序列（圖1－2），通過5′RACE擴(kuò)增得到620bp的5′端cDNA序列（圖1－3）。將3個(gè)片段拼接起來得到一全長的cDNA序列，可預(yù)測得到最長的ORF。根據(jù)該ORF序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，擴(kuò)增得到1個(gè)2.3kb的cDNA序列（圖1－4）。

測序結(jié)果與拼接的編碼序列完全吻合。這表明擴(kuò)增了該基因的ORF序列，并將該基因命名為OpVP1。

圖1 小擬南芥OpVP1基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of gene OpVP1in Olimarabidopsis pumila

2.2 OpVP1基因的生物信息學(xué)分析

OpVP1基因的cDNA全長為2698bp，含有2313bp的完整ORF，推測編碼770個(gè)氨基酸。氨基酸序列比對分析結(jié)果表明，OpVP1同擬南芥的AVP1（AAL84953）、琴葉擬南芥 AlVP1 （XP＿0028901200）、蕪菁的BrVP1（AET95910）的相似性最高，分別為98.4%、98.6%和95.3%。其與鹽芥TsVP1（AAR08913）、棉花GhVP1（ADN96173）的相似性分別為96.2%、89.1% （圖2）。

圖2 OpVP1同其他植物的H＋－PPase蛋白氨基酸序列比對分析Fig.2 Alignment analysis of OpVP1and H＋－PPase from other plants

ProtParam分析軟件推測OpVP1蛋白的分子式為C3688H5780N900O1058S34，相對分子量是80745.9Da，等電點(diǎn)pI 5.13。

用TMHMM－2.0預(yù)測表明OpVP1蛋白具有14個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)（圖3）。利用Swiss－Model workspace進(jìn)行OpVP1蛋白的同源建模（圖4），表明該蛋白的三維結(jié)構(gòu)是由2個(gè)相同的單體組成的蛋白質(zhì)二聚體，每個(gè)單體含有26個(gè)α－螺旋和5個(gè)β－折疊。其中，α－螺旋占整個(gè)氨基酸序列的75%左右，并且像柵欄似的平行排列，說明該蛋白具有膜蛋白的特點(diǎn)。

將來自不同植物的液泡膜H＋－PPase基因的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（圖5）。表明植物的H＋－PPase基因同源基因按照單子葉和雙子葉分別進(jìn)化。小擬南芥OpVP1基因與琴葉擬南芥、擬南芥、蕪菁、鹽芥等H＋－PPase基因遺傳距離最近，屬于Ⅰ型液泡膜H＋－PPase基因。

圖3 OpVP1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Transmembrane region prediction of OpVP1

圖4 OpVP1的三級結(jié)構(gòu)Fig.4 Tertiary structure of OpVP1

圖5 植物液泡膜H＋－PPase基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogentic tree of vacuole H＋ －PPase gene from different plants

2.3 OpVP1基因的組織表達(dá)分析

qRT－PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖6）表明，OpVP1基因在小擬南芥的根、莖、葉、花、果莢中均有表達(dá)，在角果中的表達(dá)最高，其次是在花中的表達(dá)，莖和葉片中的表達(dá)量相似，根中的表達(dá)最低。

圖6 qRT－PCR分析OpVP1基因的組織表達(dá)Fig.6 Expression analysis of OpVP1in different tissue of Olimarabidopsis pumila by qRT－PCR

3 討論與結(jié)論

植物液泡膜H＋－PPase在植物的耐鹽中起著作用［2－4］。通 過 RT－PCR 和 RACE 技術(shù)，從新疆 短命耐鹽植物小擬南芥中克隆了1個(gè)液泡膜H＋－PPase基因OpVP1，OpVP1基因的cDNA全長為2698 bp，5′非編碼區(qū)（UTR）長度為178bp，3′非編碼區(qū)（UTR）長度為206bp，ORF長2313bp，推測該基因編碼770個(gè)氨基酸。OpVP1蛋白的分子量約80 KDa，等電點(diǎn)pI 5.13。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明OpVP1是由2個(gè)相同的單體組成的蛋白質(zhì)二聚體，每個(gè)單體主要以α－螺旋為主。

高等植物中存在Ⅰ型和Ⅱ型2種類型的液泡膜H＋－PPase，Ⅰ型依賴K＋激活而適度被Ca2＋激活，主要分布在液泡膜上，Ⅱ型對K＋不敏感而對Ca2＋極其敏感，主要分布在高爾基體和溶酶體上［14－15］。這2種類型的H＋－PPase在氨基酸序列上親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，它們之間的同源性僅有37%～39%［16］。本研究克隆的小擬南芥H＋－PPase基因OpVP1與模式植物擬南芥Ⅰ型H＋－PPase基因AVP1的同源性為98.2%，而與Ⅱ型H＋－PPase基因AVP2的同源性僅為40%，系統(tǒng)進(jìn)化分析也表明OpVP1屬于Ⅰ型H＋－PPase基因。

基因表達(dá)分析結(jié)果表明OpVP1基因在根、莖、葉、花和果實(shí)中都有表達(dá)，但在果實(shí)中的表達(dá)比其它組織中的表達(dá)量高。已有的研究表明H＋－PPase基因在不同植物的不同組織中表達(dá)量不相同，可能在植物在長期的進(jìn)化中H＋－PPase基因的功能發(fā)生了分歧。番茄的Ⅰ型的H＋－PPase基因SlVP1在果實(shí)早期發(fā)育中起著重要作用［16］。

后期擬進(jìn)行OpVP1基因的反式作用因子和順式作用元件的分析。我們的研究將進(jìn)一步解析植物H＋－PPase基因家族如何行使功能的，豐富植物耐鹽信號傳導(dǎo)的分子機(jī)制。

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