多種除氧技術(shù)培養(yǎng)丁酸梭菌的研究

鄧 慶，廖美德

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，廣東 廣州 510642）

丁酸梭菌（Clostridium butyricum）又名酪酸菌，屬芽孢桿菌科（Bacillaceae），梭菌屬（Clostridium），革蘭氏陽性，有芽孢，孢子卵圓，偏心或次端生。丁酸梭菌是嚴(yán)格厭氧的芽孢菌[1]，產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、脂酶、纖維酶、半纖維酶等多種胞外酶，能合成泛酸、煙酸、葉酸、維生素B1、吡哆醇、核黃素等維生素類化合物，主要代謝產(chǎn)物為丁酸、乙酸[2]。自1944 年日本[3]將丁酸梭菌制劑以整腸制劑藥品正式投入臨床應(yīng)用以來，丁酸梭菌制劑在國內(nèi)外臨床應(yīng)用已有幾十年的歷史，不僅對各種原因（腸道感染、腫瘤化療、外科手術(shù)等）所致的腸道菌群紊亂[4]、急慢性腹瀉、腸易激綜合癥、非潰瘍性消化不良等疾病有良好的療效[5]，尤其對使用抗生素后所致的偽膜性腸炎有獨(dú)特的效果。

我國于1993年引入，研究時間僅20年，對于丁酸梭菌的培養(yǎng)方法改進(jìn)和應(yīng)用領(lǐng)域還有許多空間進(jìn)行探索[6]。本研究結(jié)合丁酸梭菌在畜牧養(yǎng)殖業(yè)[7]中的生產(chǎn)實(shí)際，創(chuàng)新性地采用生物除氧的培養(yǎng)方法，將酵母菌與丁酸梭菌一起混合培養(yǎng)[8]。酵母菌具有很高的營養(yǎng)價值[9]，含有豐富的蛋白質(zhì)，在畜牧業(yè)中已有悠久的應(yīng)用歷史。因此混合培養(yǎng)物[10]不僅可以為飼養(yǎng)動物提供營養(yǎng)，還能預(yù)防和治療其腸道損傷。丁酸梭菌是一種對氧敏感，嚴(yán)格厭氧生長的細(xì)菌，因此，長期以來，人們依賴厭氧生物反應(yīng)器或在培養(yǎng)基中添加還原性耗氧劑如谷胱甘肽還原鹽等方法培養(yǎng)丁酸梭菌。本實(shí)驗(yàn)采用了添加無機(jī)還原除氧劑硫代硫酸鈉、有機(jī)還原除氧劑半胱氨酸和混合培養(yǎng)3種方法來培養(yǎng)丁酸梭菌，目的是提高丁酸梭菌的生物量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

丁酸梭狀芽孢桿菌（Clostridium butyricum）：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

液體硫乙醇鹽培養(yǎng)基：酪蛋白胨15g，L-胱氨酸0.5g，葡萄糖5g，酵母膏5g，氯化鈉2.5g，硫乙醇酸鈉0.5g，刃天青（resazurin）0.001g，瓊脂0.75g，次甲基蘭0.05g，蒸餾水1000mL，pH 7.1。

酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基[11]：蛋白胨2g，酵母膏1g，葡萄糖2g，次甲基蘭0.05g，蒸餾水100mL，pH 7.0。

1.1.3 試劑

液體硫乙醇鹽培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；蛋白胨、酵母菌：英國Oxoid公司；無水葡萄糖（分析純）、次甲基蘭（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；L-胱氨酸（純度≥98.0%）：上海伯奧生物科技有限公司；硫代硫酸鈉（分析純）：北京劉李店化工廠；瓊脂粉：廣州華奇盛生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UVmini-1240紫外可見分光光度計：日本島津公司；CX31顯微鏡：日本OLYMPUS公司；XB-K-25血球計數(shù)板：上海安信光學(xué)儀器制造有限公司；303A-2S恒溫電熱培養(yǎng)箱：上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；TCYQ恒溫振蕩培養(yǎng)箱：廣州深華生物技術(shù)有限公司；DHP-9052恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HRAYAMA高壓滅菌鍋：華粵行儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 丁酸梭菌生長曲線測定

將配制好的含9mL液體硫乙醇鹽培養(yǎng)基的試管隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，按1%菌種量接丁酸梭菌于實(shí)驗(yàn)組試管中，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)，每隔8h分別測定實(shí)驗(yàn)組與對照組培養(yǎng)基OD600nm值（測定前，充分振蕩），用實(shí)驗(yàn)組OD600nm值減去對照組OD600nm值，即得此時菌體OD600nm值，根據(jù)OD600nm值繪制丁酸梭菌生長曲線[12]。

1.3.2 丁酸梭菌OD600nm、酵母菌OD600nm與其生物量的關(guān)系曲線測定

丁酸梭菌OD600nm、酵母菌OD600nm與其生物量的關(guān)系：選取5個不同菌體濃度的丁酸梭菌菌液、酵母菌菌液，分別測定其OD600nm，并用血球計數(shù)板在顯微鏡下數(shù)出不同OD600nm對應(yīng)的菌數(shù)，建立擬合曲線。

單一丁酸梭菌、酵母菌菌液OD600nm與混合菌液OD600nm關(guān)系：隨機(jī)選取5個相同體積不同菌體濃度的丁酸梭菌和酵母菌單一懸液，分別測定OD600nm，然后將兩者按不同體積混合后，測定混合液OD600nm，測定單一丁酸梭菌、酵母菌菌液OD600nm與混合菌液OD600nm關(guān)系曲線。

1.3.3 無機(jī)還原物除氧能力

分別添加質(zhì)量濃度為0g/mL、0.018g/mL、0.036g/mL、0.054g/mL、0.072g/mL、0.090g/mL無機(jī)還原化合物硫代硫酸鈉1mL于含8mL液體硫乙醇鹽培養(yǎng)基的試管中，使各試管中硫代硫酸鈉的質(zhì)量濃度分別為0.000g/mL、0.002g/mL、0.004g/mL、0.006g/mL、0.008g/mL、0.010g/mL。培養(yǎng)基高溫滅菌（121℃、15min）后，按1%接種量接入丁酸梭菌種子液于培養(yǎng)基中，37℃恒溫箱培養(yǎng)，每隔12h觀察試管中藍(lán)色液體的高度，次甲基蘭遇氧變藍(lán)，因此溶液顯示藍(lán)色即表示含有氧氣。實(shí)驗(yàn)中藍(lán)色層越高表示氧氣滲入量越大。

1.3.4 無機(jī)還原化合物對丁酸梭菌生物量的影響

在8mL硫乙醇鹽培養(yǎng)基中，分別添加質(zhì)量濃度分別為0g/mL、0.009g/mL、0.0018g/mL、0.0027g/mL、0.0036g/mL、0.0045g/mL、0.0054g/mL 無機(jī)還原化合物硫代硫酸鈉1mL，培養(yǎng)基高溫滅菌（121℃、15min）后，隨機(jī)分為對照組與實(shí)驗(yàn)組，按1%接種量接入丁酸梭菌種子液于實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中（對照組加入等量無菌水），置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)48h，分別測定實(shí)驗(yàn)組與對照組OD600nm值，按照OD600nm值與其生物量關(guān)系的回歸方程計算丁酸梭菌生物量[13]。

1.3.5 有機(jī)還原劑對丁酸梭菌生物量的影響

在8mL硫乙醇鹽培養(yǎng)基中，分別添加質(zhì)量濃度分別為0g/mL、0.009g/mL、0.0018g/mL、0.0027g/mL、0.0036g/mL、0.0045g/mL有機(jī)還原化合物半胱氨酸1mL，培養(yǎng)基高溫滅菌（121℃、15min）后，隨機(jī)分為對照組與實(shí)驗(yàn)組，按1%接種量接入丁酸梭菌種子液于實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中（對照組加入等量無菌水），置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)48h，分別測定實(shí)驗(yàn)組與對照組OD600nm值，按照OD600nm值與其生物量關(guān)系的回歸方程計算丁酸梭菌生物量[13]。

1.3.6 不同接種量對單一培養(yǎng)丁酸梭菌、酵母菌于YPD中生物量的影響

分別按1%、2%、3%、4%、5%接菌量接種單一丁酸梭菌、酵母菌于YPD培養(yǎng)基中。30℃恒溫培養(yǎng)48h后，測定菌液OD600nm值，觀察丁酸梭菌在無任何除氧劑的YPD培養(yǎng)基中是否生長以及酵母菌的接種量是否對其生物量有影響[14]。

1.3.7 混合培養(yǎng)對丁酸梭菌生物量的影響

將配制好的含9mL YPD培養(yǎng)基的試管隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，用移液槍按表1的體積比分別接丁酸梭菌與酵母菌于實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中（接種量為1%）后，實(shí)驗(yàn)組和對照組放在30℃條件下，同時分別測定接種液的OD600nm值，按照OD600nm值與其生物量關(guān)系的回歸方程計算丁酸梭菌生物量。實(shí)驗(yàn)組和對照組培養(yǎng)48h后測定其OD600nm值，并用血球計數(shù)板計算得出酵母菌數(shù)，按照OD600nm值與其生物量關(guān)系的回歸方程計算丁酸梭菌生物量[15]。

表1 混合培養(yǎng)丁酸梭菌與酵母菌的接種比例Table 1 Inoculation ratio of mixture culture ofC.butyricum andS.cerevisiae

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸梭菌生長曲線

丁酸梭菌在硫乙醇鹽培養(yǎng)基上生長曲線測定結(jié)果見圖1。圖1數(shù)據(jù)為培養(yǎng)液稀釋10倍后的測定值（下同）。從丁酸梭菌生長曲線中可知，在2h 以前是遲緩期，2h～10h為丁酸梭菌生長的對數(shù)期，10h后進(jìn)入對數(shù)生長后期，16h后進(jìn)入穩(wěn)定期，40h左右生長達(dá)到頂值，之后是衰亡期。后期研究中選取丁酸梭菌生長對數(shù)期進(jìn)行接種。

圖1 丁酸梭菌生長曲線Fig.1 Growth curve ofC.butyricum

2.2 丁酸梭菌OD600nm、酵母菌OD600nm與其生物量的關(guān)系曲線測定

2.2.1 酵母菌OD600nm與生物量（細(xì)胞濃度）關(guān)系

酵母菌懸液OD600nm值與與其生物量對應(yīng)關(guān)系如圖2所示，經(jīng)回歸分析得到回歸方程（1）：

式中：Y 為酵母菌生物量，107個/mL，X 為酵母菌懸液OD600nm值。

圖2 酵母菌OD600nm與菌體量關(guān)系Fig.2 The relationship betweenOD600nm ofS.cerevisiae and biomass

2.2.2 丁酸梭菌OD600nm與生物量關(guān)系圖

丁酸梭菌懸液OD600nm值與其生物量（細(xì)胞濃度）關(guān)系見圖3，經(jīng)回歸分析得到回歸方程（2）：

式中：Y 為丁酸梭菌的生物量，107個/mL，X 為丁酸梭菌懸液的OD600nm值。

2.2.3 單一丁酸梭菌、酵母菌菌液OD600nm與混合液OD600nm的關(guān)系

圖3 丁酸梭菌OD600nm與菌體量關(guān)系Fig.3 The relationship betweenOD600nm ofC.butyricum and biomass

將等體積不同OD600nm的丁酸梭菌與酵母菌混合，測定其混合液OD600nm值，結(jié)果見圖4。由圖4可知，丁酸梭菌、酵母菌及混合菌液OD600nm值可以由（3）式計算。

圖4 單一丁酸梭菌、酵母菌菌液OD600nm與混合液OD600nm的關(guān)系Fig.4 The relationship betweenOD600nm of singleC.butyricum,S.cerevisiae andOD600nm of broth mixture

2.3 次甲基蘭指示硫代硫酸鈉除氧效果分析

圖5 次甲基藍(lán)指示硫代硫酸鈉的除氧效果Fig.5 Deoxidize effect of thiosulfate sodium indicated by methylene blue

由圖5可知，培養(yǎng)初期，硫代硫酸鈉的添加量與除氧效果成正相關(guān)，但隨著培養(yǎng)時間的延長，氧氣不斷擴(kuò)散進(jìn)入，藍(lán)色層高度逐漸增加。到培養(yǎng)末期（50h），硫代硫酸鈉的添加量為0g/mL～0.006g/mL的藍(lán)色層的高度幾乎一致為8cm，表明培養(yǎng)末期硫代硫酸鈉的添加量與除氧效果無相關(guān)性。硫代硫酸鈉的添加量分別為0.008g/mL和0.010g/mL時藍(lán)色層高度分別為5cm和6cm，表明高質(zhì)量濃度硫代硫酸鈉對除氧具有較好的效果。藍(lán)色溶液高度越小，表明除氧效果越好，越有利于丁酸梭菌生長。

2.4 無機(jī)還原活性物除氧劑對丁酸梭菌生長的影響

以無機(jī)還原活性物硫代硫酸鈉作除氧劑對丁酸梭菌生長的影響測定結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，當(dāng)硫代硫酸鈉的添加量為0g/mL～0.004g/mL，丁酸梭菌的生物量與添加量成正相關(guān)。當(dāng)硫代硫酸鈉的添加量為0.004g/mL時丁酸梭菌的OD600nm值最大。當(dāng)添加量大于0.004g/mL時，丁酸梭菌的生物量與添加量成負(fù)相關(guān)，因此硫代硫酸鈉除氧的最佳添加量是0.004g/mL。

圖6 硫代硫酸鈉添加量與菌體量關(guān)系Fig.6 The relationship between dosage of sodium thiosulfate and biomass

2.5 有機(jī)還原活性物除氧劑半胱氨酸對丁酸梭菌生長的影響

有機(jī)還原活性物半胱氨酸（還原型）除氧劑對丁酸梭菌生長的影響測定結(jié)果見圖7。從圖7可知，當(dāng)半胱氨酸的添加量為0g/mL～0.004g/mL，丁酸梭菌的生物量與添加量成正相關(guān)。當(dāng)半胱氨酸的添加量是0.004g/mL時丁酸梭菌的OD600nm值最大。當(dāng)添加量大于0.004g/mL，丁酸梭菌的生物量與添加量成負(fù)相關(guān)，因此半胱氨酸除氧的最佳添加量是0.004g/mL。

圖7 半胱氨酸添加量與菌體量關(guān)系Fig.7 The relationship cysteine added volume and biomass

2.6 不同接種量對單一培養(yǎng)丁酸梭菌、酵母菌于YPD中生物量的影響

分別按1%、2%、3%、4%、5%的接菌量接種單一丁酸梭菌、酵母菌于YPD培養(yǎng)基中，然后放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，測定其OD600nm。酵母菌接種量與酵母菌生物量關(guān)系曲線見圖8。由圖8可知，酵母菌能在YPD中較好的生長，但其接菌量對酵母菌生物量幾乎無影響。丁酸梭菌單一培養(yǎng)于YPD中，接種量與丁酸梭菌生物量關(guān)系曲線見圖9。由圖9可知，丁酸梭菌單一培養(yǎng)于YPD中是不生長的。

圖8 在YPD培養(yǎng)基中不同接菌量與酵母菌生物量關(guān)系Fig.8 The relationship between different inoculum ofS.cerevisiae and its biomass in YPD medium

圖9 在YPD培養(yǎng)基中不同丁酸梭菌接菌量與其生物量關(guān)系Fig.9 The relationship between different inoculum ofC.butyricum and its biomass in YPD medium

2.7 不同接菌量對混合培養(yǎng)中酵母菌與丁酸梭菌生物量的影響

圖10 不同接菌量對混合培養(yǎng)中酵母菌與丁酸梭菌生物量的影響Fig.10 Effect of different inoculum of mixed culture on biomass ofS.cerevisiae andC.butyricum

不同比例接種量對酵母菌、丁酸梭菌生物量的影響見圖10。由圖10可知，酵母菌與丁酸梭菌共培養(yǎng)體系可以保證良好的厭氧環(huán)境，但二種菌種的初始接種比例對酵母菌和丁酸梭菌的生長有很大影響，當(dāng)丁酸梭菌與酵母菌接種菌體量比是0.517（體積比）時，丁酸梭菌生物量達(dá)最大值5.238×107個/mL，此時酵母菌生物量為1.68×106個/mL。當(dāng)接種菌體量比是1.206（體積比）時，酵母菌生物量達(dá)最大值2×106個/mL，此時丁酸梭菌生物量為4.953×107個/mL。但過高的酵母菌添加量會抑制丁酸梭菌的生長，其原因有待于進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著除氧劑添加質(zhì)量濃度的升高，除氧效率有所提高，當(dāng)硫代硫酸鈉和半胱氨酸質(zhì)量濃度為0.004g/mL時，丁酸梭菌生物生長量分別達(dá)到最大值3.49×108個/mL和4.24×108個/mL，當(dāng)除氧劑添加量超過0.004g/mL時，丁酸梭菌的生長受到抑制；但除氧劑不能持續(xù)的除氧，至培養(yǎng)末期，除氧劑的除氧效果幾乎沒有除氧能力。以YPD為培養(yǎng)基，不同接種比例混菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丁酸梭菌與酵母菌之間存在一定的協(xié)同關(guān)系，當(dāng)丁酸梭菌與酵母菌接種菌體量比是0.517時，丁酸梭菌生物量達(dá)最大值5.238×107個/mL，酵母菌生物量為1.68×106個/mL。

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