熒光衍生法測(cè)定中藥二氧化硫殘留量研究

彭月，李雪蓮，銀玲，陳鴻平，樊丹青，劉友平

[摘要] 目的：采用衍生化反應(yīng)，建立熒光分光光度法測(cè)定中藥中二氧化硫的殘留量。方法：對(duì)影響熒光強(qiáng)度的因素進(jìn)行研究，確定最佳衍生條件。在激發(fā)波長(zhǎng)321 nm，發(fā)射波長(zhǎng)384 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度。結(jié)果：熒光強(qiáng)度與Na₂SO₃對(duì)照品加入量在0.999 7～17.99 nmol線性關(guān)系良好，r=0.999 9，平均回收率102.3%，RSD 4.6%。結(jié)論：該法具有簡(jiǎn)便易行，快速準(zhǔn)確，靈敏度高等特點(diǎn)，可為中藥材二氧化硫殘留量的測(cè)定提供參考。

[關(guān)鍵詞] 熒光分光光度法；衍生；二氧化硫殘留量；中藥

硫磺是一種古老的用于中藥防蟲(chóng)的藥物，不少中藥材產(chǎn)地加工時(shí)都會(huì)硫熏，利用硫磺加熱產(chǎn)生的二氧化硫達(dá)到漂白藥材及殺菌防霉防蟲(chóng)的目的，由于硫磺熏蒸后中藥材的性狀及化學(xué)成分多有改變，且熏蒸后的中藥材中殘留的二氧化硫?qū)θ梭w有很大傷害[1]，《中國(guó)藥典》2005年版取消了藥材的“硫磺熏蒸養(yǎng)護(hù)法”， 并在《中國(guó)藥典》2010年版附錄中增加了基于蒸餾法的二氧化硫殘留量測(cè)定法，由于該法要求專門的全玻璃蒸餾儀器，推廣很慢，其他測(cè)定中藥二氧化硫殘留量的方法尚有鹽酸副玫瑰苯胺法[2]、高效液相色譜法[3]、氣相色譜法[4]和離子色譜法[5]等，但鹽酸副玫瑰苯胺法操作過(guò)程中需使用有毒的四氯汞鈉溶液，幾種色譜法需要相應(yīng)的設(shè)備及填充柱等，檢測(cè)成本較高。

本研究根據(jù)亞硫酸鈉-鄰苯二甲醛-銨鹽在中性或弱酸性條件下反應(yīng)生成具有強(qiáng)烈熒光的化合物1-磺酸基-異吲哚，首次建立了熒光衍生法用于中藥材二氧化硫殘留量測(cè)定的方法，具有靈敏度高，選擇性好，分析速度較快等優(yōu)點(diǎn)，以期為中藥材二氧化硫殘留量的測(cè)定提供一種新的參考方法。

1 材料

RF-5301（PC）S熒光分光光度計(jì)（日本島津公司）；電子分析天平BP211D（1/10 萬(wàn)，德國(guó)Sartorius公司），電子分析天平BP121S（1/1 萬(wàn)，德國(guó)Sartorius公司）；pHS-3C型酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）；WHY-2水浴恒溫振蕩器（江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）；恒溫水浴鍋W201B（北京國(guó)華醫(yī)療器械廠）。

亞硫酸鈉對(duì)照品（美國(guó)Fisher公司，批號(hào)120224，純度99.5%）；其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為重蒸餾水；中藥材樣品購(gòu)于荷花池中藥材市場(chǎng)，均經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定。

2 方法

2.1 試劑配制

亞硫酸鈉對(duì)照品儲(chǔ)備液：精密稱取亞硫酸鈉對(duì)照品適量，加水溶解制成1 mmol·L^-1亞硫酸鈉對(duì)照品儲(chǔ)備液，避光冷藏，使用時(shí)用水稀釋至所需濃度。

鄰苯二甲醛溶液：準(zhǔn)確稱取0.134 1 g鄰苯二甲醛，無(wú)水乙醇溶解后定容至100 mL棕色量瓶中作為儲(chǔ)備液，避光冷藏，使用時(shí)移取10.0 mL定容至100 mL配成1 mmol·L^-1的鄰苯二甲醛工作液。

乙酸銨溶液：準(zhǔn)確稱取7.708 0 g乙酸銨（AR），用水溶解后定容至1 000 mL棕色量瓶中作為儲(chǔ)備液，避光冷藏，使用時(shí)移取5.0 mL定容至100 mL配成5 mmol·L^-1乙酸銨工作液。

磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液：將濃度為0.3 mol·L^-1的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀溶液按照不同體積比混合，配成一系列不同pH的緩沖溶液。

2.2 熒光衍生法測(cè)定

準(zhǔn)確移取2.0 mL 磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液（pH 6.44），適量樣品溶液于10 mL量瓶中，依次加入1 mmol·L^-1鄰苯二甲醛溶液2.5 mL及5 mmol·L^-1乙酸銨溶液1.5 mL，混勻，用水定容，于50 ℃水浴中恒溫5 min，取出，立即放入冰水中冷卻，終止反應(yīng)，靜置40 min，以試劑空白為參比，于1 cm的石英比色皿中測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)為321 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為384 nm時(shí)樣品的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

3 結(jié)果

3.1 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

按實(shí)驗(yàn)方法配制溶液，然后在熒光分光光度計(jì)上分別掃描其激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，見(jiàn)圖1，可知體系的最佳激發(fā)波長(zhǎng)為321 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為384 nm。

3.2 試驗(yàn)條件的選擇

3.2.1 緩沖液pH及其用量的影響 試驗(yàn)考察了不同pH 磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響，見(jiàn)圖2，發(fā)現(xiàn)pH在6.37 ～ 6.47，衍生物的相對(duì)熒光強(qiáng)度大且穩(wěn)定。當(dāng)pH為6.44，產(chǎn)物的相對(duì)熒光強(qiáng)度最大，故選擇pH 6.44的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液作為測(cè)定的酸度條件，其加入量2.0 mL較為適宜。

3.2.2 鄰苯二甲醛用量的影響 取適量的亞硫酸鈉分別加入不同體積的1 mmol·L^-1鄰苯二甲醛溶液，經(jīng)衍生后測(cè)定產(chǎn)物的相對(duì)熒光強(qiáng)度，見(jiàn)圖3，表明隨著鄰苯二甲醛溶液用量的增大，產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度先增大后降低，當(dāng)其用量為2.5 mL時(shí)，熒光強(qiáng)度最大，繼續(xù)增加用量產(chǎn)物熒光強(qiáng)度反而降低，故本實(shí)驗(yàn)選擇加入1 mmol·L^-1鄰苯二甲醛溶液2.5 mL。

3.2.3 乙酸銨濃度及用量的影響 試驗(yàn)考察了不同濃度乙酸銨對(duì)衍生物熒光強(qiáng)度的影響，見(jiàn)圖4，隨著乙酸銨濃度的增大，衍生物的熒光強(qiáng)度先增大后降低，當(dāng)乙酸銨濃度為5 mmol·L^-1時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，故本實(shí)驗(yàn)選擇5 mmol·L^-1乙酸銨溶液，其加入量1.5 mL較為適宜。

3.2.4 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的影響 按實(shí)驗(yàn)方法，分別在不同溫度和反應(yīng)時(shí)間下進(jìn)行衍生反應(yīng)，然后測(cè)定產(chǎn)物的相對(duì)熒光強(qiáng)度，見(jiàn)圖5，表明50 ℃水浴中反應(yīng)5 min最佳，然后立即冰水浴冷卻，終止反應(yīng)。

3.2.5 靜置時(shí)間的影響 按實(shí)驗(yàn)方法對(duì)對(duì)照品試樣衍生化處理后，靜置一定時(shí)間后測(cè)定其相對(duì)熒光強(qiáng)度，見(jiàn)圖6，隨靜置時(shí)間延長(zhǎng)產(chǎn)物相對(duì)熒光強(qiáng)度有所降低，當(dāng)靜置在30～50 min衍生物相對(duì)熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，故本實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)完成后靜置40 min測(cè)定產(chǎn)物的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

3.3 供試品溶液的制備

取中藥細(xì)粉約1 g，精密稱定，精密加入0.5%氫氧化鈉溶液25 mL，搖勻，振蕩提?。?00 r·min^-1，40 ℃） 30 min，濾過(guò)，取1.0 mL稀釋至25 mL，即得。

3.4 方法學(xué)驗(yàn)證

3.4.1 線性關(guān)系試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1，0.3，0.7，1.2，1.5，1.8 mL用水稀釋至100 mL，然后再分別移取上述不同濃度的稀釋液1.0 mL，按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定產(chǎn)物的相對(duì)熒光強(qiáng)度。以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，亞硫酸鈉對(duì)照品的加入量（nmol）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=46.247 X-15.007， r²=0.999 8，表明亞硫酸鈉加入量在0.999 7～ 17.99 nmol線性關(guān)系良好。

3.4.2 精密度試驗(yàn) 取同一批山藥樣品，按3.3項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，平行測(cè)定6次，記錄熒光強(qiáng)度，計(jì)算RSD 1.6%，表明儀器精密度良好。

3.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取已制備好的同一份樣品溶液，測(cè)定前避光冷藏，按上述實(shí)驗(yàn)方法分別在0，0.5，1，1.5，2，2.5 h測(cè)定，記錄熒光強(qiáng)度，結(jié)果2 h內(nèi)樣品熒光強(qiáng)度的RSD 2.8%，表明樣品溶液在避光冷藏的條件下2 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批次山藥樣品，按供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，按上述實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定其熒光強(qiáng)度，結(jié)果樣品中二氧化硫質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均為 411.4 μg·g-1，RSD 1.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.4.5 加樣回收試驗(yàn) 取已知二氧化硫含量的同批次山藥樣品6份，約0.5 g，精密稱定，精密加入亞硫酸鈉對(duì)照品溶液適量，按供試品溶液的制備與測(cè)定同法操作，測(cè)定熒光強(qiáng)度，計(jì)算二氧化硫含量與回收率，得平均回收率為102.3%，RSD 4.6%，見(jiàn)表1。

3.4.6 樣品測(cè)定 按照建立的方法測(cè)定所購(gòu)買部分中藥材的二氧化硫含量，見(jiàn)表2。

4 討論

基于亞硫酸鈉-鄰苯二甲醛-銨鹽在中性或弱酸性條件下反應(yīng)生成具有強(qiáng)烈熒光的化合物1-磺酸基-異吲哚的原理，本研究建立了一種測(cè)定中藥中二氧化硫含量的新方法。較之《中國(guó)藥典》2010年版附錄規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法需特制的全玻璃蒸餾裝置，測(cè)定過(guò)程中人為、偶然誤差較大，該熒光衍生法操作過(guò)程可控，人為誤差小。本方法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度和準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，對(duì)常見(jiàn)離子進(jìn)行熒光光譜的干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)亞硫酸鈉的加入量為12.00 nmol，相對(duì)誤差在5%內(nèi)時(shí)，100倍的Na⁺，K⁺，NH₄⁺，Cl^-，HCO₃^-，NO₂^-，SCN^-，H₂PO₄^-，HPO₄^2-，S^2-，SO₄^2-，CO₃^2-等的存在對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。利用該法對(duì)山藥、葛根、枸杞和麥冬的測(cè)定與2010年版《中國(guó)藥典》方法結(jié)果較一致，對(duì)于方法的測(cè)定結(jié)果可靠性的驗(yàn)證有待進(jìn)一步研究。

中藥硫熏過(guò)程中，單質(zhì)硫經(jīng)加熱氧化成二氧化硫，與中藥里的無(wú)機(jī)元素生成亞硫酸鹽，以游離態(tài)、可逆結(jié)合態(tài)和不可逆結(jié)合態(tài)3種形式存在。本研究采用堿性溶液提取樣品，可將其中可逆結(jié)合態(tài)的亞硫酸鹽釋放出來(lái)，并對(duì)振蕩提取法提取過(guò)程中的某些影響因素進(jìn)行研究，結(jié)果確定的提取時(shí)間比標(biāo)準(zhǔn)方法大大縮短，利用此方法對(duì)山藥、葛根、枸杞和麥冬進(jìn)行一次提取，與2010年版《中國(guó)藥典》規(guī)定方法比較各藥提取率均在90%以上，表明振蕩提取法可作為一種樣品前處理方法用于中藥二氧化硫殘留量的測(cè)定。該法采用儀器提取的方式，自動(dòng)化程度較高，適用于大批量樣品的提取。

本研究應(yīng)用建立的熒光衍生法對(duì)部分中藥材中的二氧化硫含量進(jìn)行測(cè)定，與中藥材中二氧化硫殘留量檢測(cè)限度征求意見(jiàn)稿規(guī)定的限量進(jìn)行比較，購(gòu)買的藥材中二氧化硫殘留量均不符合要求，提示目前中藥硫熏的現(xiàn)象仍然存在，對(duì)中藥材硫熏的替代加工技術(shù)有待深入研究。

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Determination of sulfur dioxide in traditional Chinese

medicine by derivative fluorometry

PENG Yue， LI Xue-lian， YIN Ling， CHEN Hong-ping， FAN Dan-qing， LIU You-ping*

（Laboratory Constructed by PRC and Sichuan Province in Systematically Research and Development

Utilization of Traditional Chinese Medicine Resources， Department of Pharmacy， Chengdu

University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China）

[Abstract] Objective： To establish a derivative fluorometry method for the determination of sulfur dioxide residues in traditional Chinese medicine. Method： The optimal derivation condition was established. The fluorescence intensity was detected at excitation wavelength of 321 nm， and emission wavelength of 384 nm. Result： A linear relationship was obtained between the fluorescence intensity and the addition of reference substance in the range of 0.999 7-17.99 nmol with a correlation coeffient of 0.999 9， and the average recovery was 102.3% with RSD 4.6%. Conclusion： This method is simple and sensitive with quick and correct result. It can provide a reference for the determination of sulfur dioxide residues in traditional Chinese medicine.

[Key words] fluorescence spectrophotometry； derivative； sulfur dioxide residues； traditional Chinese medicine

doi：10.4268/cjcmm20130214

[責(zé)任編輯 孔晶晶]