薄層生物自顯影技術(shù)比較新疆2種洋甘菊抗氧化活性

韓松林，李新霞，勉強輝，蘭衛(wèi)，劉巖

[摘要] 目的： 比較新疆2種洋甘菊——母菊和羅馬洋甘菊抗氧化活性成分差異。方法： 采用薄層-生物自顯影技術(shù)，以1，1-二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl， DPPH）自由基為實驗模型，經(jīng)薄層掃描獲得各抗氧化成分的峰面積，從而對2種洋甘菊的揮發(fā)油提取物、黃酮提取物進行抗氧化活性成分的分析，以總峰面積大小為指標比較不同提取物的抗氧化能力，并與2種洋甘菊黃酮提取物總的抗氧化活性進行比較。結(jié)果：母菊揮發(fā)油提取物顯現(xiàn)烯炔雙環(huán)醚等4個白色抗氧化斑點，羅馬洋甘菊揮發(fā)油提取物顯現(xiàn)1個白色抗氧化斑點，薄層掃描結(jié)果表明母菊揮發(fā)油提取物抗氧化斑點峰面積大于羅馬洋甘菊揮發(fā)油提取物；2種洋甘菊黃酮提取物紫外-可見分光光度法抗氧化活性測定結(jié)果表明，母菊清除50%DPPH自由基的質(zhì)量濃度為0.66 g·L^-1，羅馬洋甘菊清除50%DPPH自由基的質(zhì)量濃度為0.33 g·L^-1；2種洋甘菊黃酮提取物薄層生物自顯影實驗結(jié)果表明，母菊黃酮提取物顯現(xiàn)芹菜素、芹苷元-7-葡萄糖苷等7個淡黃色抗氧化斑點，羅馬洋甘菊黃酮提取物顯現(xiàn)芹菜素、芹苷元-7-葡萄糖苷等8個淡黃色抗氧化斑點，薄層掃描結(jié)果表明羅馬洋甘菊黃酮提取物抗氧化斑點峰面積大于母菊黃酮提取物。結(jié)論：2種洋甘菊揮發(fā)油提取物抗氧化活性TLC差異顯著，母菊揮發(fā)油提取物抗氧化活性強于羅馬洋甘菊揮發(fā)油提取物；母菊揮發(fā)油提取物中已知抗氧化活性成分為烯炔雙環(huán)醚，其他3個抗氧化活性成分以及羅馬洋甘菊揮發(fā)油提取物中1個抗氧化活性成分均為未知化合物，有待進一步確定；鑒于2種洋甘菊揮發(fā)油提取物抗氧化活性斑點數(shù)差異顯著，可應用于2種洋甘菊的鑒別區(qū)分。2種洋甘菊黃酮提取物抗氧化活性測定結(jié)果、薄層生物自顯影實驗結(jié)果一致，母菊、羅馬洋甘菊黃酮提取物都具有較強的抗氧化活性，且羅馬洋甘菊黃酮提取物的抗氧化活性強于母菊黃酮提取物；2種洋甘菊黃酮提取物中均含已知抗氧化活性成分芹菜素、芹苷元-7-葡萄糖苷，母菊黃酮提取物中其他5個抗氧化活性成分以及羅馬洋甘菊中其他6個抗氧化活性成分均為未知成分，有待進一步確定。該方法為進一步鑒定洋甘菊抗氧化活性成分奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 母菊；羅馬洋甘菊；DPPH；薄層生物自顯影；薄層掃描；抗氧化

新疆有2種常用洋甘菊，一種是德國洋甘菊，為一年生草本植物，即母菊，學名Matricaria chamomilla L.，植物名Matricaria recutita[1]；一種是羅馬洋甘菊，一至多年生草本，學名Anthemis nobile L.，植物名Chamaemelum nobile。母菊頭狀花序干燥后是一種重要的藥用植物和香料植物，在食品和飲料行業(yè)，其精油和提取物用作調(diào)味劑成分，還可用于化妝品、肥皂、漱口液的制造。羅馬洋甘菊在民間主要以茶飲用，工業(yè)上主要用于食品、化妝品等行業(yè)。市場上母菊價格昂貴，羅馬洋甘菊相對便宜。2種洋甘菊外觀極為相似，肉眼難以區(qū)分，常借助顯微鑒別，化學成分分析等加以區(qū)分。2種洋甘菊都具有藥用價值，母菊具有消炎、抑制真菌、解痙等作用[2-4]；羅馬洋甘菊具有抑制惡心、嘔吐、消化不良、食欲不振等作用[5]，但維吾爾藥志記載母菊和羅馬洋甘菊藥物作用基本一致[2]。母菊主要含有α-紅沒藥醇、芹菜素苷、木犀草素-7-葡萄糖苷、芹苷元-7-葡萄糖苷[6]等化學成分；羅馬洋甘菊主要含有芹菜素、芹菜素苷、槲皮素、倍半萜內(nèi)酯、藍香油薁等化學成分[7]。在歐洲洋甘菊有很悠久的使用歷史，1882年母菊就收入德國藥典[8]。美國藥典收載的品種為母菊，薄層鑒別以龍腦、乙酸龍腦酯和愈創(chuàng)奧為參照物對照鑒別其中的烯炔雙環(huán)醚、沒藥醇和萜類化合物；含量測定采用HPLC測定芹苷元-7-葡萄糖苷含量；并以紅沒藥醇為對照品，采用GC測定揮發(fā)油中沒藥烷衍生物的總含量。但歐盟藥典收載的品種是羅馬洋甘菊，薄層鑒別以芹菜素、芹苷元-7-葡萄糖苷為對照品進行鑒別。母菊在維吾爾醫(yī)中是常用藥材，國家藥品標準維吾爾藥分冊（1998年版）就已收載該品種的藥材，同時收入的3種制劑：復方木尼孜其顆粒、祖卡木顆粒、強力瑪?shù)檬苛Π喬孛鄹嗑阅妇諡樗幉娜胨?。雖然國家藥品標準維吾爾藥分冊收載了母菊，但只有顯微鑒別，沒有薄層鑒別和含量測定，現(xiàn)已列為國家藥品標準提高品種。

現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)人類的多種疾病都與自由基對機體的氧化損傷有關(guān)，自由基是機體生命活動中產(chǎn)生的一種活性分子，在正常代謝情況下，自由基起著調(diào)節(jié)細胞間的信號傳遞和細胞生長、抑制病毒和細菌的作用；機體內(nèi)過多自由基會損傷生物細胞的膜結(jié)構(gòu)，包括蛋白質(zhì)、脂類、核酸、碳水化合物，從而引發(fā)炎癥、肺氣腫、腫瘤、動脈粥樣硬化等多種疾病[9-11]?？寡趸钚允呛芏嗵烊划a(chǎn)物類化合物的藥效機制之一，目前常用抗氧化活性測定方法包括1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH·）法，羥基自由基（·OH）法，超氧自由基（O₂^-·）法。近年來，DPPH作為抗氧化模型與薄層色譜相結(jié)合，形成了薄層色譜-生物自顯影技術(shù)，國內(nèi)谷麗華等首次將薄層色譜-生物自顯影技術(shù)應用于中藥質(zhì)量評價， 發(fā)展了基于平面色譜技術(shù)的生物檢定法[12-13]，開始應用于中藥抗氧化活性成分的導向分離、鑒定和品質(zhì)評價研究，并且《中國藥典》（2010年版）[14]也引入了該活性檢測方法。DPPH法薄層色譜-生物自顯影技術(shù)中，DPPH與具有抗氧化活性的物質(zhì)結(jié)合，生成DPPH-H 而呈現(xiàn)白色或淡黃色，薄層板本身顯紫色，從而篩選出抗氧化活性組分[15]。該技術(shù)結(jié)合了比色法（或熒光法）與色譜分離技術(shù)二者的優(yōu)點，具有操作簡單、耗費低、靈敏度、專屬性高等特點，是一種集鑒定、分離、活性測定于一體的藥物篩選方法[11]。

國內(nèi)外關(guān)于2種洋甘菊的抗氧化活性僅有少量報道， PovilA_itytoee V等[16]采用紫外-可見分光光度法對羅馬洋甘菊的揮發(fā)油提取物的抗氧化活性進行了研究，楊俊杰等[17]采用紫外-可見分光光度法研究了母菊揮發(fā)油提取物的抗氧化活性。為進一步比較系統(tǒng)地了解2種洋甘菊的抗氧化活性成分，本文采用DPPH法薄層生物自顯影技術(shù)對2種洋甘菊的揮發(fā)油提取物、黃酮提取物同時進行抗氧化活性成分分析。本文中首先測定了2種洋甘菊黃酮提取物的抗氧化能力，之后采用DPPH法薄層色譜-生物自顯影技術(shù)分析了2種洋甘菊揮發(fā)油提取物及黃酮提取物的抗氧化成分，為2種洋甘菊的鑒別區(qū)分及后續(xù)活性成分的分離分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料

半自動點樣儀（CAMAG LINOMAT5），薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（CAMAG REPROSTAR3），薄層色譜掃描儀（CAMAG ScannerⅢ），薄層板加熱儀（CAMAG TLC PLATEHEATERⅢ），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELA ROTARY EVAPORA TOR N1001），分光光度儀（Cintra 404），氮吹儀（HSC-12A），100 μL微量進樣針，雙槽展開缸（20 cm×10 cm），硅膠G預制板（5 cm×10 cm，Merk），聚酰胺薄膜（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）；

愈創(chuàng)奧（SIGMA-ALDRICH），龍腦（中國食品藥品檢定研究院，批號8KT6-BLVP），乙酸龍腦酯（中國食品藥品檢定研究院，批號NZTU-EQ63），芹苷元-7-葡糖糖苷（成都普瑞科技有限公司），芹菜素（成都普瑞科技有限公司），十二烷基硫酸鈉（SIGMA-ALDRICH），香草醛（成都市科龍化工試劑廠），1，1-二苯基苦基苯肼（SIGMA-ALDRICH），甲苯、正庚烷、甲醇、乙醇、甲酸（分析純，天津市富宇精細化工有限公司），正丁醇（分析純，天津市福晨化學試劑廠），二氯甲烷（分析純，天津永晟精細化工有限公司），三氯甲烷、冰醋酸（分析純，天津市化學試劑三廠），濃硫酸（分析純，北京化工廠）。

母菊，采于新疆策勒；羅馬洋甘菊，采于新疆。

2 方法與結(jié)果

2.1 2種洋甘菊黃酮提取物抗氧化活性測定

DPPH甲醇溶液呈深紫色，其最大吸收波長為517 nm。當有抗氧劑存在時，抗氧劑與DPPH單電子配對而使其逐漸褪色，可見光區(qū)517 nm處的吸收逐漸消失，其褪色程度與接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，以清除率表示其抗氧化能力的強弱[18]：清除率S=1-（A_i-A_j）/A₀，其中，A₀為DPPH·與甲醇混合液的吸光度，A_i為DPPH·與樣品反應后的吸光度（30 ℃水浴0.5 h），A_j為樣品與甲醇混合液的吸光度；

2.1.1 DPPH溶液的制備 稱取DPPH對照品約8 mg，置100 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，配成0.08 g·L^-1的溶液。在200～800 nm掃描，得到DPPH溶液的最大吸收波長517 nm。

2.1.2 母菊、羅馬洋甘菊對DPPH的清除能力測定 稱取母菊花粉末 （過3號篩）0.831 1 g，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇30 mL，超聲處理10 min（60 ℃水浴），放至室溫，濾過，取甲醇10 mL沖洗具塞錐形瓶，清洗液濾過，合并濾液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，即得16.62 g·L^-1母菊儲備液。吸取母菊儲備液0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL至10 mL量瓶中，得母菊系列質(zhì)量濃度為0.083 1，0.166 2，0.332 4，0.664 8，0.997 2，1.329 6，1.662 0 g·L^-1；稱取羅馬洋甘菊花粉末（過3號篩） 0.829 2 g，同法處理得羅馬洋甘菊儲備液16.58 g·L^-1及系列質(zhì)量濃度0.082 9，0.165 8，0.331 6，0.663 2，0.994 8，1.326 4，1.658 0 g·L^-1。

吸取DPPH溶液2 mL，加入甲醇2 mL，在517 nm處測定吸光度A₀為0.921；吸取DPPH溶液2 mL，加入一系列濃度母菊溶液1 mL，再加入甲醇1 mL，30 ℃水浴0.5 h后，在517 nm處測定吸光度A_i；空白對照為甲醇3 mL分別加相對應母菊系列溶液1 mL，在517 nm處測定吸光度A_j；同法測定羅馬洋甘菊系列液，按照清除率公式計算母菊、羅馬洋甘菊對DPPH的清除率，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，清除50%DPPH的母菊花質(zhì)量濃度、羅馬洋甘菊花質(zhì)量濃度（EC50）分別為0.66，0.33 g·L^-1，羅馬洋甘菊黃酮提取物的抗氧化活性大于母菊黃酮提取物。

2.2 薄層生物自顯影分析2種洋甘菊的抗氧化活性成分

2.2.1 揮發(fā)油提取物抗氧化活性成分的分析 對照品溶液的制備：取龍腦、乙酸龍腦酯、愈創(chuàng)奧對照品，加甲苯制成每1 mL分別含1，2，4 mg的混合溶液，作為對照品溶液。供試品溶液的制備：取2種洋甘菊花粗粉各1 g，分別置具塞錐形瓶中，加二氯甲烷10 mL，置室溫浸泡1 h，濾過，濾液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀35 ℃下濃縮，然后氮吹儀吹干，殘渣加甲苯0.5 mL使溶解，作為供試品溶液。

母菊、羅馬洋甘菊供試品溶液，龍腦、乙酸龍腦酯、愈創(chuàng)奧混合對照品溶液分別點于同一硅膠G薄層板（5 cm×10 cm）上，以氯仿為展開劑，展開后取出，晾干，噴以1%香草醛濃硫酸溶液，在105 ℃加熱5 min，置可見光下檢視[19]。

母菊、羅馬洋甘菊供試品溶液分別點于另一硅膠G薄層板（5 cm×10 cm）上，同法展開晾干后噴0.008% DPPH甲醇溶液，30 min后，置可見光下檢視，以及在檢測波長410 nm，參比波長517 nm下進行雙波長掃描測定[20]。2種洋甘菊花揮發(fā)油提取物抗氧化活性結(jié)果見表1。

1%香草醛濃硫酸顯色可見光下檢視，首先確定參照物龍腦、乙酸龍腦酯、愈創(chuàng)奧的相對位置，根據(jù)參照物Rf確定供試品中3種成分沒藥醇、烯炔雙環(huán)醚、萜類化合物的位置。噴以0.008%DPPH甲醇溶液后置可見光下檢視及薄層掃描，母菊揮發(fā)油提取物抗氧化活性成分的峰面積為3 038、羅馬洋甘菊揮發(fā)油提取物抗氧化活性成分的峰面積為632，母菊揮發(fā)油提取物顯現(xiàn)4個白色斑點，羅馬洋甘菊揮發(fā)油提取物顯現(xiàn)1個白色斑點，說明2種洋甘菊揮發(fā)油提取物都含有清除DPPH自由基的抗氧化活性成分，且母菊揮發(fā)油提取物抗氧化活性強于羅馬洋甘菊揮發(fā)油提取物；根據(jù)Rf確定母菊揮發(fā)油提取物中含有烯炔雙環(huán)醚等4個抗氧化活性成分，羅馬洋甘菊揮發(fā)油提取物中含有1個未知的抗氧化活性成分，母菊中其他3個白色斑點屬于具有抗氧化活性的未知化合物。1%香草醛濃硫酸顯色條件下，2種洋甘菊薄層色譜差異性較小，DPPH顯色后，2種洋甘菊薄層色譜斑點數(shù)目差異明顯，可應用于2種洋甘菊的鑒別區(qū)分。

2.2.2 黃酮類成分抗氧化成分的分析 對照品溶液的制備：取芹菜素對照品、芹苷元-7-葡萄糖苷對照品，加甲醇制成每1 mL各含0.25 mg的混合溶液，作為對照品溶液。供試品溶液的制備：取2種洋甘菊花粗粉各0.5 g，分別置具塞錐形瓶中，加甲醇10 mL，超聲處理5 min（60 ℃水?。胖潦覝?，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。表1 2種洋甘菊揮發(fā)油提取物抗氧化活性母菊、羅馬洋甘菊供試品溶液，芹菜素、芹苷元-7-葡萄糖苷混合對照品溶液，分別點于同一聚酰胺板（5 cm×10 cm）上。稱取十二烷基硫酸鈉（表面活性劑）6.7 g，正丁醇（助表面活性劑）15.8 g，正庚烷（油相）2.5 g，水75 g，放置24 h制得75%O/W微乳液；以75%O/W微乳液-甲酸（9∶2）為展開劑，展開后取出，晾干，噴以0.008%DPPH甲醇溶液，置紫外光燈（254 nm）和可見光下檢視以及對其峰面積進行雙波長掃描測定（λ₁=410 nm，λ₂=517 nm）。2種洋甘菊花黃酮提取物抗氧化活性結(jié)果見表2。

以DPPH紫外光燈（254 nm）檢視結(jié)果確定芹苷元-7-葡萄糖苷、芹菜素的位置；可見光下檢視及薄層掃描，母菊黃酮提取物抗氧化活性成分的峰面積為11 554（其中芹菜素727，芹苷元-7-葡萄糖苷4 442），羅馬洋甘菊黃酮提取物抗氧化活性成分的峰面積為16 277（其中芹菜素3 061，芹苷元-7-葡萄糖苷2 453），母菊黃酮提取物顯現(xiàn)芹菜素、芹苷元-7-葡萄糖苷等7個淡黃色斑點，羅馬洋甘菊黃酮提取物顯現(xiàn)芹菜素、芹苷元-7-葡萄糖苷等8個淡黃色斑點，說明2種洋甘菊黃酮提取物都含有較強清除DPPH自由基作用的抗氧化活性成分，且羅馬洋甘菊黃酮提取物的抗氧化活性強于母菊黃酮提取物；根據(jù)Rf確定2種洋甘菊黃酮提取物中都含有芹菜素、芹苷元-7-葡萄糖苷等抗氧化活性成分，母菊黃酮提取物中其他5個淡黃色斑點及羅馬洋甘菊黃酮提取物中其他6個淡黃色斑點屬于具有抗氧化活性的未知化合物。該薄層色譜條件下，2種洋甘菊黃酮提取物能較好分離。

3 討論

1%香草醛濃硫酸顯色結(jié)果確定參照物龍腦、乙酸龍腦酯、愈創(chuàng)奧的相對位置[19]；DPPH顯色后，根據(jù)參照物Rf確定供試品揮發(fā)油提取物中的抗氧化活性成分為烯炔雙環(huán)醚等。DPPH薄層生物自顯影分析2種洋甘菊黃酮提取物抗氧化活性成分除芹菜素、芹苷元-7-葡萄糖苷外，還含有其他結(jié)構(gòu)的化學成分。

薄層生物自顯影篩選結(jié)果顯示，2種洋甘菊揮發(fā)油提取物都具有一定的抗氧化活性，母菊白色斑點數(shù)多于羅馬洋甘菊，且母菊揮發(fā)油提取物抗氧化斑點峰面積大于羅馬洋甘菊揮發(fā)油提取物，說明母菊揮發(fā)油提取物抗氧化活性強于羅馬洋甘菊揮發(fā)油提取物；2種洋甘菊黃酮提取物都具有較強的抗氧化活性，薄層生物自顯影篩選結(jié)果顯示羅馬洋甘菊黃酮提取物抗氧化斑點峰面積大于母菊黃酮提取物，并與總黃酮提取物抗氧化能力的測定結(jié)果一致。

本實驗在分析2種洋甘菊揮發(fā)油提取物抗氧化活性過程中，考察了歐洲藥典中冰醋酸-水-正丁醇（17∶17∶66）展開系統(tǒng)[21]，但DPPH顯色后供試品中斑點成白色條帶狀，拖尾嚴重，分離度差；然后采用微乳展開系統(tǒng)含水量75%O/W微乳液-甲酸（9∶2）優(yōu)化后，斑點清晰，分離效果較好，但微乳條件下抗氧化斑點為淡黃色，可能與聚酰胺板作為薄層固定相有關(guān)。

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Comparison of antioxidant activity between two species of chamomiles

produced in Xinjiang by TLC-bioautography

HAN Song-lin1，2， Li Xin-xia1*， MIAN Qiang-hui1， LAN Wei1， LIU Yan3

（1. Xinjiang Medical University， Urumqi 830054， China； 2. Aksu Vocational and Technical College， Aksu 843000， China；

3. Bill Brother Biotechnology Co.， Ltd.， Urumqi 830011， China）

[Abstract] Objective： To compare the antioxidant active components from two species of chamomile-matricaria and Roman chamomile produced in Xinjiang. Method： The TLC-bioautography was used， with 1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） radical as the experimental model. The peak areas of various antioxidant components were obtAined by TLC-scanning for analyzing antioxidant active components contAined in volatile oil extracts and flavone extracts from the two species of chamomiles. The total peak area was taken as the indicator for comparing the antioxidant capacities of the two types of extracts， and comparing them with the total antioxidant activity of flavone extracts of the two species of chamomiles. Result： According to the result of TLC-bioautography in volatile oil extracts from the two species of chamomiles， volatile oil extracts from chamomile showed four white antioxidant spots， including en-yne-dicycloether， and volatile oil extracts from Roman chamomile showed only one white antioxidant spot. The TLC-scanning result showed that the peak area of antioxidant spots of volatile oil extracts from chamomile was significantly larger than that of volatile oil extracts from Roman chamomile. According to the test on the antioxidant activity of the two species of chamomiles with ultraviolet-visible spectrophotometry， the concentration of chamomile after scavenging 50% of DPPH radicals was 0.66 g·L^-1， whereas the figure for Roman chamomile was 0.33 g·L^-1. According to the result of TLC-bioautography in flavone extracts from the two species of chamomiles， flavone extracts from chamomile showed seven yellowish antioxidant spots， including apigenin and apigenin-7-glucoside， and flavone extracts of Roman chamomile showed eight yellowish antioxidant spots， including apigenin and apigenin-7-glucoside. The TLC-scanning results showed that the peak area of antioxidant spots of flavone extracts from Roman chamomile was significantly larger than that of flavone extracts from chamomile. Conclusion： Volatile oil extracts from the two species of chamomiles have significant difference in the antioxidant activity in TLC-bioautography. Specifically， the antioxidant activity of volatile oil extracts from chamomile is stronger than volatile oil extracts from Roman chamomile； the known antioxidant active components in volatile oil extracts from chamomile is en-yne-dicycloether， while all of the other three antioxidant active components as well as antioxidant active components in volatile oil extracts from Roman chamomile are unknown components and remAin to be further determined. Considering the significant difference in the number of antioxidant active spots in volatile oil extracts from the two species of chamomiles， the result can be applied to distinguish the two species of chamomiles. The antioxidant activity determination result for flavone extracts from two species of chamomiles was consistent with the result of TLC-bioautography， showing that flavone extracts from chamomile and Roman chamomile are more antioxidant active， while that of Roman chamomile is stronger than chamomile. Flavone extracts from both of the two species of chamomiles contAin apigenin and pigenin-7-glucoside， which are known， while all of the other five antioxidant active components contAined in flavone extracts from chamomile and the other six antioxidant active components contAined in flavone extracts from Roman chamomile are unknown and remAin to be further identified. The method lays a foundation for further identification of antioxidant active components contAined in chamomile.

[Key words] chamomile； Roman chamomile； DPPH； TLC-bioautography； TLC-scanning； antioxidant activity

doi：10.4268/cjcmm20130210

[責任編輯 曹陽陽]