復(fù)方苦參注射液聯(lián)合放射治療對肺癌Lewis細(xì)胞株在體外的放射增敏作用研究

段哲萍，于新江，劉媛媛

當(dāng)前，肺癌的發(fā)病率及死亡率均已高居各類惡性腫瘤之首，且逐年增高，對人類健康造成嚴(yán)重威脅，腫瘤的高轉(zhuǎn)移率和腫瘤細(xì)胞的耐藥性為其致死的最重要原因，通過何種途徑提高療效、減輕放化療毒副作用、降低腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移已成為肺癌治療的重中之重[1-2]。大量研究表明，腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移同瘤體內(nèi)新生血管高度相關(guān)，所以抑制瘤體內(nèi)新生血管生成、切斷腫瘤血液的供應(yīng)，能夠抑制腫瘤生長和血行轉(zhuǎn)移[3]。已有研究證明復(fù)方苦參注射液可抑制腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移，進(jìn)而改善臨床癥狀，配合放化療應(yīng)用具有顯著的減毒增效作用[4]。本實驗檢測復(fù)方苦參注射液聯(lián)合放射治療對小鼠肺癌Lewis細(xì)胞株的腫瘤血管新生及腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的抑制作用，為中藥聯(lián)合放射治療肺癌提供確實的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 小鼠肺癌Lewis細(xì)胞株，由河北醫(yī)科大學(xué)免疫教研室饋贈，用于建立小鼠腫瘤模型。

1.1.2 實驗動物 6周齡左右、健康SPF級、雄性C57BL/6小鼠60只，體質(zhì)量20～25 g，來自于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，清潔級環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)基：DMEM(批號：cat NO 12800-017,lot NO 1164642)、RPMI-1640(批號：cat NO 31800-022,lot NO 688600)、胎牛血清 (優(yōu)級，批號：130624),購于GIBICO BRL公司。培養(yǎng)基加用丁胺卡那霉素為華北制藥股份有限公司產(chǎn)品。復(fù)方苦參注射液購自山西振東制藥有限公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 瑞典醫(yī)科達(dá)公司精確治療系統(tǒng)全數(shù)字化直線加速器；日本東芝放射治療模擬定位機(jī)；英國ADAC計算機(jī)三維適形放射治療計劃系統(tǒng)；二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱：SANYO；恒溫水浴箱:PolyScience or HAAKE DC3；高速離心機(jī)5417R，Eppendorf公司，德國；普通高速離心機(jī)5415D：Eppendorf公司，德國；微量振蕩器MH-1：江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司。超凈工作臺：吳江市凈化設(shè)備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肺癌Lewis細(xì)胞株快速復(fù)蘇后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于恒溫培養(yǎng)箱中(37 ℃，5%CO2)培養(yǎng)。每日在倒置顯微鏡下觀察，2～3 d更換培養(yǎng)液傳代。

1.2.2 動物模型的制作 取對數(shù)生長期肺癌Lewis細(xì)胞株，以0.25%胰酶消化，用磷酸鹽緩沖液(PBS)將腫瘤細(xì)胞自培養(yǎng)瓶壁刮下，移至離心管，2 000 r/min，離心10 min，離心半徑13.5 cm，棄上清液，加入PBS，重復(fù)離心2次，洗去血清，臺盼藍(lán)染色，PBS調(diào)細(xì)胞濃度至1×107個/ml。C57BL/6小鼠60只，1 ml注射器將0.1 ml腫瘤細(xì)胞懸液接種于右側(cè)腋窩皮下。觀察腫瘤生長進(jìn)程1次/3 d，12 d左右皮下可觸及腫物，直徑5～7 mm，成瘤率90%以上。

1.2.3 分組 選取腫瘤結(jié)節(jié)形狀規(guī)則、與肌肉皮膚無明顯粘連的小鼠40只用于實驗，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：對照組、復(fù)方苦參注射液組、單純放療組和聯(lián)合治療組，每組各10只。對照組：0.9%氯化鈉溶液3 ml/kg腹腔注射，第12～16天，1次/d，共5次。模擬放射治療，第12、14、16、18天，0 Gy/次，共4次。復(fù)方苦參注射液組：復(fù)方苦參注射液3 ml/kg腹腔注射，第12～16天，1次/d，共5次。模擬放射治療，第12、14、16、18天，0 Gy/次，共4次。單純放療組：0.9%氯化鈉溶液3 ml/kg腹腔注射，第12～16天，1次/d，共5次。采用6 MV-X線放射治療，第12、14、16、18天，5 Gy/次，共4次。聯(lián)合治療組：復(fù)方苦參注射液3 ml/kg腹腔注射，第12～16天，1次/d，共5次，同時采用6 MV-X線放射治療，第12、14、16、18天，5 Gy/次，共4次。

1.2.4 指標(biāo)檢測 (1)治療開始后每3 d用游標(biāo)卡尺測量各組小鼠腫瘤長徑(a)及短徑(b)，計算腫瘤平均體積，觀察記錄腫瘤結(jié)節(jié)的外觀、質(zhì)地、活動度等生長情況。腫瘤體積計算公式：腫瘤體積(mm3)=a×b2/2。(2)腫瘤抑制率=1-實驗組體積/對照組體積。(3)第27天處死各組小鼠取標(biāo)本，取腫瘤組織、肺組織稱重，再迅速以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，組織切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，免疫組化檢測。

取小鼠腫瘤組織及肺組織以10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片，以3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化酶活性，微波修復(fù)，加入兔抗鼠血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抗體/兔抗人CD34抗體，4 ℃過夜，工作濃度分別為1∶50和1∶1 000，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，以黃色、棕色、棕褐色為陽性表達(dá)。VEGF陽性細(xì)胞比例評分以陽性細(xì)胞百分比≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，>80%為4分；染色強(qiáng)度評分以細(xì)胞無著色為0分，胞質(zhì)、核膜黃色為1分，胞質(zhì)、核膜棕黃色為2分，胞質(zhì)、核膜棕褐色為3分。陽性細(xì)胞比例評分與染色強(qiáng)度評分之和即為VEGF免疫組化評分，隨機(jī)檢查5個高倍視野，計算VEGF免疫組化評分，取其平均值。

在顯微鏡(×100倍)低倍視野下找尋微血管稠密區(qū)域，再在(×400倍)高倍視野下行微血管計數(shù)，取平均值計為微血管密度(MVD)。微血管判斷標(biāo)準(zhǔn)：血管內(nèi)皮細(xì)胞簇棕色或單個內(nèi)皮細(xì)胞與比鄰微血管、腫瘤細(xì)胞及其他結(jié)締組織分開，計為1個微血管。

1.2.5 放射治療方法 先將小鼠進(jìn)行麻醉(10%氯胺酮200 mg/kg腹腔注射)，麻醉成功后固定于解剖板，使腫塊局部充分暴露，模擬機(jī)定位，腫瘤徹底包括于射野下，偏轉(zhuǎn)機(jī)頭15°～20°避免照射正常肺組織，采用高能X射線(能量6 MV)，使用1.0～2.0 cm限光筒。對照組及復(fù)方苦參組輸出劑量率為0 Gy/min，單純放療組及聯(lián)合治療組輸出劑量率為2.4 Gy/min。

2 結(jié)果

2.1 不同組腫瘤體積比較 C57BL/6小鼠接種0.1 ml 1×107個/ml肺癌腫瘤細(xì)胞建立動物模型，待接種后12 d腫瘤增至5～7 mm時開始進(jìn)行治療，結(jié)果顯示，接種后12、15 d對照組、復(fù)方苦參組、單純放療組及聯(lián)合治療組小鼠腫瘤體積比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；接種后18、21、24、27 d復(fù)方苦參組、單純放療組、聯(lián)合治療組小鼠腫瘤體積較對照組均減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；接種后18、21、24、27 d聯(lián)合治療組小鼠腫瘤體積較復(fù)方苦參組和單純放療組均減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；接種后21、24、27 d單純放療組小鼠腫瘤體積較復(fù)方苦參組均減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.2 不同組腫瘤數(shù)量、腫瘤質(zhì)量及腫瘤抑制率比較 復(fù)方苦參組、單純放療組和聯(lián)合治療組小鼠較對照組肺內(nèi)腫瘤數(shù)量和腫瘤質(zhì)量均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；單純放療組和聯(lián)合治療組較復(fù)方苦參組腫瘤數(shù)量和腫瘤質(zhì)量均降低，腫瘤抑制率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合治療組較單純放療組腫瘤質(zhì)量降低，腫瘤抑制率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

2.3 VEGF免疫組化評分比較 VEGF免疫組化結(jié)果以黃棕色為陽性著色，位于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)及新生毛細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞。4組VEGF免疫組化評分比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；復(fù)方苦參組、單純放療組和聯(lián)合治療組較對照組均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

2.4 MVD比較 4組MVD比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中復(fù)方苦參組、單純放療組和聯(lián)合治療組較對照組均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

表2 不同組腫瘤數(shù)量、腫瘤質(zhì)量及腫瘤抑制率比較

Table2 Comparison of number,weight,and inhibition rate of tumor among groups

組別例數(shù)腫瘤數(shù)量(個)腫瘤質(zhì)量(g)腫瘤抑制率(%)對照組105.24±1.44 3.45±1.20 -復(fù)方苦參組104.19±1.35* 2.68±1.04* 24.97 單純放療組102.85±1.26*△2.16±0.99*△ 35.32△ 聯(lián)合治療組102.40±1.44*△1.32±0.75*△▲56.53△▲F(χ2)值8.84910.26021.087☆P值0.007 0.003 0.000

注：與對照組比較，*P<0.05；與復(fù)方苦參組比較，△P<0.05；與單純放療組比較，▲P<0.05；☆為χ2值；-為無此項

Table3 Comparison of VEGF immunohistochemistry score and MVD among groups

組別例數(shù)VEGF免疫組化評分(分)MVD(個)對照組105.038±0.645 42.73±12.56 復(fù)方苦參組103.562±0.112*32.81±9.04*單純放療組104.257±0.300*29.55±7.11*聯(lián)合治療組102.895±0.073*17.42±4.26*F值21.8634.508P值 0.000 0.039

注：VEGF=血管內(nèi)皮生長因子，MVD=微血管密度；與對照組比較，*P<0.05

表1 不同組腫瘤體積比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與聯(lián)合治療組比較，▲P<0.05；與復(fù)方苦參組比較，△P<0.05

3 討論

放射治療已經(jīng)歷了一個多世紀(jì)的發(fā)展歷史，在倫琴發(fā)現(xiàn)X線、居里夫婦發(fā)現(xiàn)鐳之后，很快就分別用于臨床治療惡性腫瘤，直到目前放射治療仍是惡性腫瘤重要的局部治療方法。放射治療發(fā)展較快，超高壓治療機(jī)的使用、輔助工具的改進(jìn)和經(jīng)驗的積累，使放射治療的效果得到顯著提高，目前已成為惡性腫瘤治療中的最重要手段之一。不過，由于某些惡性腫瘤對放射線敏感性低，同時放射治療難以抑制遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，致使治療失敗。目前，惡性腫瘤主要的治療模式是放射治療、化學(xué)療法綜合治療，但由于毒副作用過大，常無法順利完成治療。如何提高放射治療的療效，提高惡性腫瘤局部控制率，降低轉(zhuǎn)移率，與此同時最大限度減少對正常組織的破壞，是當(dāng)前腫瘤學(xué)工作者亟待解決的問題。

復(fù)方苦參注射液主要成分包括苦參、白土茯苓，具有清熱解毒、除濕涼血、散結(jié)止痛的功效。近年研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方苦參注射液有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，提高機(jī)體免疫力，減輕癌痛、腫瘤熱以及減輕化療引起的胃腸道反應(yīng)等作用，進(jìn)一步研究顯示，復(fù)方苦參注射液對于胃癌組織中新生血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有抑制作用[5-6]。

本實驗采用肺癌Lewis細(xì)胞株建立動物模型，接種12 d后腫瘤增至5～7 mm時開始進(jìn)行治療，結(jié)果顯示，接種后12、15 d對照組、復(fù)方苦參組、單純放療組及聯(lián)合治療組小鼠腫瘤體積無差異；接種后18、21、24、27 d復(fù)方苦參組、單純放療組、聯(lián)合治療組小鼠腫瘤體積較對照組均減小，說明無論是放射治療還是復(fù)方苦參注射液對腫瘤細(xì)胞的生長均有抑制作用；接種后18、21、24、27 d聯(lián)合治療組小鼠腫瘤體積較復(fù)方苦參組和單純放療組均減小，說明聯(lián)合治療的抑瘤效果更好。接下來不同組腫瘤數(shù)量、腫瘤質(zhì)量及腫瘤抑制率比較中，復(fù)方苦參組、單純放射療組和聯(lián)合治療組小鼠肺內(nèi)腫瘤數(shù)量和腫瘤質(zhì)量均降低；與單純放療組、復(fù)方苦參組比較，聯(lián)合治療組腫瘤質(zhì)量降低，腫瘤抑制率升高，也同樣證實中藥聯(lián)合放射治療腫瘤效果優(yōu)于單純放射治療及中藥治療。

有研究表明當(dāng)腫瘤體積小于2 mm3時，腫瘤細(xì)胞營養(yǎng)供給和代謝產(chǎn)物排泄主要依賴于周圍組織的彌散作用，而當(dāng)腫瘤體積大于2 mm3時，則必須由新生血管來提供營養(yǎng)，此時腫瘤體積常會迅速增大，大量腫瘤細(xì)胞釋放易于發(fā)生血行轉(zhuǎn)移。本實驗探討了復(fù)方苦參注射液聯(lián)合放射治療對于肺癌Lewis細(xì)胞株荷瘤小鼠移植瘤生長和血管生成的抑制作用，結(jié)果復(fù)方苦參注射液單獨或聯(lián)合放射治療均表現(xiàn)出良好的腫瘤抑制作用，與對照組相比，移植瘤生長減慢、體積縮小、質(zhì)量減輕、腫瘤轉(zhuǎn)移能力降低，其中單純放療組效果優(yōu)于復(fù)方苦參組，而聯(lián)合治療組抑瘤率更是達(dá)到56.53%，高于單獨使用(單純放療組35.32%，復(fù)方苦參組24.97%)。

VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長因子，可在體內(nèi)誘導(dǎo)新生血管，為已知最主要的誘導(dǎo)血管新生的因子，可與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面受體特異性結(jié)合，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分裂及遷移，對血管新生起關(guān)鍵作用，并且VEGF還可提高血管通透性，有助于腫瘤細(xì)胞通過血管壁進(jìn)入血循環(huán)，進(jìn)而向其他器官轉(zhuǎn)移。MVD在一定程度上反映惡性腫瘤血管生成程度，與惡性腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移能力呈正比，是判斷非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的主要指標(biāo)之一。所以，抑制腫瘤組織中的VEGF表達(dá)可有效抑制血管新生，延緩腫瘤轉(zhuǎn)移[7-9]。本研究采用免疫組化法檢測腫瘤組織中VEGF及MVD，結(jié)果顯示對照組VEGF免疫組化評分和MVD最高，復(fù)方苦參注射液及放射治療均可降低肺癌組織中VEGF的表達(dá)和MVD，而兩者聯(lián)合應(yīng)用則表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗新生血管作用。

綜上所述，復(fù)方苦參注射液聯(lián)合放射治療可通過下調(diào)VEGF表達(dá)，抑制腫瘤中微血管生成，發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的協(xié)同作用，值得進(jìn)一步在臨床推廣應(yīng)用。

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