胃癌及癌前病變中幽門螺桿菌感染與分泌型卷曲相關(guān)蛋白基因啟動(dòng)子甲基化的關(guān)系研究

杜美林，王小玲，樊建平，張立瑋，內(nèi)田智久，村上和成，王 續(xù)，劉月平，王士杰

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，也是主要的表觀遺傳疾病，近年來學(xué)者對(duì)胃癌的表觀遺傳學(xué)關(guān)注度極高，表觀遺傳學(xué)包括基因甲基化、組蛋白修飾、微小RNA調(diào)控等[1]。其中基因甲基化備受關(guān)注，很多基因的甲基化與腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系，是腫瘤發(fā)生的重要因素，并且關(guān)系著腫瘤的進(jìn)展、治療及預(yù)后。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，進(jìn)一步研究信號(hào)傳導(dǎo)通路在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，尋求抗腫瘤藥物治療的新靶點(diǎn)是腫瘤研究的新熱點(diǎn)，其中研究最多的是Wnt通路，分泌型卷曲相關(guān)蛋白(secreted frizzled-related proteins，SFRPs)在此通路中發(fā)揮了重要作用。正常情況下，SFRPs競爭性抑制Fz受體，使Wnt通路的轉(zhuǎn)錄激活信號(hào)封閉，從而使調(diào)控下游基因表達(dá)的β-連環(huán)蛋白處于穩(wěn)定狀態(tài)；當(dāng)SFRPs基因發(fā)生甲基化時(shí)，導(dǎo)致Wnt通路激活，細(xì)胞過度增殖，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[2]。大量研究已表明SFRPs的高甲基化可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，尤其在消化道腫瘤中高表達(dá)[3]。

此外，幽門螺桿菌(H.pylori)是已確認(rèn)的胃癌Ⅰ類致癌原，這與H.pylori菌株不同、宿主基因易感性及環(huán)境因素有關(guān)。H.pylori本身不能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，但是其感染后的代謝產(chǎn)物及感染引起的炎性反應(yīng)促使原癌基因相繼被激活，抑癌基因丟失或功能失活，出現(xiàn)基因表達(dá)異?；蚬δ馨l(fā)生改變，從而引起細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤形成[4-5]。有研究顯示，在胃癌及癌前病變中H.pylori感染可能與異常DNA甲基化相關(guān)[6]。故根除H.pylori是否能逆轉(zhuǎn)基因甲基化？本研究探討了H.pylori感染致SFRPs基因啟動(dòng)子甲基化的機(jī)制和相關(guān)性，以期為胃癌的治療提供新療法。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 隨機(jī)抽取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2012年10—11月內(nèi)鏡咬檢不同胃黏膜病變標(biāo)本72例，其中胃癌40例，異型增生17例，慢性胃炎15例；中位年齡為43歲；男女比例為3.8∶1。患者均未接受過任何治療，除胃病以外無其他疾病，并有完整的臨床病理資料及隨訪資料，且患者均為無親緣關(guān)系的河北省漢族人。

1.2 方法 每例患者均在胃組織同一部位取2塊標(biāo)本，1塊于-20 ℃保存用于提取全基因組DNA，另1塊放入10%甲醛溶液中固定，留作病理組織學(xué)檢查及免疫組化檢測。

1.2.1 提取全基因組DNA 采用Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒提取標(biāo)本的基因組DNA，選用亞硫酸氫鈉(NaHSO3)、對(duì)苯二酚、氫氧化鈉(NaOH)、蒸餾水的混合溶液進(jìn)行DNA的修飾。然后采用Wizard?DNA Clean-Up System試劑盒，加入80%異丙醇2 ml、3 mol/L NaOH 2 ml、10 mol/L醋酸銨5 ml、pH 8.3 Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBS)、70%乙醇，按步驟進(jìn)行DNA純化。

1.2.2 甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP) 由于引物序列的特異性，會(huì)出現(xiàn)兩種情況：一是甲基化特異引物(M)擴(kuò)增出目的條帶，而非甲基化特異引物(U)無條帶擴(kuò)出，這種情況為甲基化；二是U擴(kuò)增出目的條帶，而M無條帶擴(kuò)出，這種情況為非甲基化。本研究的引物均由上海生工生物工程技術(shù)公司合成，包含SFRPs的甲基化與非甲基化位點(diǎn)的基因片段。擴(kuò)增片段長度分別為SFRP1：M 113 bp、U 112 bp；SFRP2：M 153 bp、U 163 bp；SFRP4：M 155 bp、U 163 bp；SFRP5：M 113 bp、U 119 bp。

MSP的反應(yīng)體系為：10×MSP Buffer 2 μl、25 mmol/L氯化鎂(MgCl2)1.2 μl、2 mmol/L dNTP 1 μl、50 μmol/L primer1 1 μl、50 μmol/L primer2 1 μl、5 U/μl Taq酶0.5 μl、NaHSO3修飾過的DNA 2.5 μl、H2O 2.3 μl，總體積為20 μl。MSP擴(kuò)增之后的產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，后于紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照并保存。以DNA Marker作為對(duì)照，觀測長度為各自堿基數(shù)目的擴(kuò)增片段。

如果在含有上游引物SFRP1的反應(yīng)體系中出現(xiàn)113 bp擴(kuò)增片段的標(biāo)本，表明是SFRP1甲基化基因片段，112 bp是SFRP1非甲基化基因片段(見圖1)；在含上游引物SFRP2的反應(yīng)體系中出現(xiàn)153 bp擴(kuò)增片段的標(biāo)本，表明是SFRP2甲基化基因片段，163 bp是SFRP2非甲基化基因片段(見圖2)；在含有上游引物SFRP4的反應(yīng)體系中出現(xiàn)155 bp的擴(kuò)增片段的標(biāo)本，表明是SFRP4甲基化的基因片段，163 bp是SFRP4非甲基化基因片段(見圖3)；在含有上游引物SFRP5的反應(yīng)體系出現(xiàn)113 bp的擴(kuò)增片段的標(biāo)本，表明是SFRP5的甲基化基因片段，119 bp是SFRP5非甲基化基因片段(見圖4)。

1.2.3 免疫組化法(SP法)檢測胃黏膜組織H.pylori的表達(dá) 內(nèi)鏡下取胃黏膜活檢組織快速固定于10%甲醛溶液中，24 h后取出，然后在常溫下梯度脫水、透明、浸蠟、包埋，蠟塊常溫保存。按照SP法的步驟將保存好的蠟塊進(jìn)行切片，并進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加二抗(快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物)，磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行沖洗，室溫孵育，最后滴加顯色劑進(jìn)行顯色，鏡下觀察H.pylori的感染情況。

注：m為DNA Marker(500、400、300、200、150、100、75、50 bp)，M為甲基化的SFRP1基因，U為非甲基化的SFRP1基因；1～2為胃癌組，3為異型增生組，4為慢性胃炎組

圖1 SFRP1基因電泳圖

Figure1 Electrophoresis of SFRP1 gene

注：m為DNA Marker(500、400、300、200、150、100、75、50 bp)，M為甲基化的SFRP2基因，U為非甲基化的SFRP2基因；1～2為胃癌組，3為異型增生組，4為慢性胃炎組

圖2 SFRP2基因電泳圖

Figure2 Electrophoresis of SFRP2 gene

注：m為DNA Marker(500、400、300、200、150、100、75、50 bp)，M為甲基化的SFRP4基因，U為非甲基化的SFRP4基因；1～2為胃癌組，3為異型增生組，4為慢性胃炎組

圖3 SFRP4基因電泳圖

Figure3 Electrophoresis of SFRP4 gene

注：m為DNA Marker(500、400、300、200、150、100、75、50 bp)，M為甲基化的SFRP5基因，U為非甲基化的SFRP5基因；1～2為胃癌組，3為異型增生組，4為慢性胃炎組

圖4 SFRP5基因電泳圖

Figure4 Electrophoresis of SFRP5 gene

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。H.pylori感染與SFRPs基因啟動(dòng)子甲基化之間的關(guān)系采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同胃黏膜病變組織SFRPs基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài) 72例標(biāo)本中，測得SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5基因啟動(dòng)子甲基化分別為34例(47.2%)、36例(50.0%)、27例(37.5%)和30例(41.7%)。不同胃黏膜病變組SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5基因啟動(dòng)子甲基化率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；慢性胃炎組、異型增生組、胃癌組SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5基因啟動(dòng)子甲基化率依次增加，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

表1 不同胃黏膜病變組織中SFRPs基因啟動(dòng)子甲基化率比較〔n(%)〕

Table1 Comparison of methylation rate of SFRPs gene in the tissues of different gastric mucosal lesions

組別例數(shù)SFRP1SFRP2SFRP4SFRP5慢性胃炎組150000異型增生組17 5(29.4)* 6(35.3)* 2(11.8)* 4(23.5)* 胃癌組4029(72.5)*△30(75.0)*△25(62.5)*△26(65.0)*△χ2值28.42529.25826.20524.011P值 0.000 0.000 0.000 0.000

注：SFRP=分泌型卷曲相關(guān)蛋白；與慢性胃炎組比較，*P<0.05；與異型增生組比較，△P<0.05

2.2 不同胃黏膜病變組織H.pylori感染率比較 72例標(biāo)本中，22例(30.6%)感染H.pylori；不同胃黏膜病變組織H.pylori感染率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；胃癌組、慢性胃炎組、異型增生組胃黏膜H.pylori感染率依次增加，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

表2 不同胃黏膜病變組織中H.pylori感染率比較〔n(%)〕

Table2 Comparison of H.pylori infection rate in different gastric mucosa lesions

組別例數(shù)H.pylori+ -慢性胃炎組15 5(33.3) 10(66.7)異型增生組1713(76.5)* 4(23.5) 胃癌組40 4(10.0)*△ 36(90.0)χ2值24.120P值 0.000

注：與慢性胃炎組比較，*P<0.05；與異型增生組比較，△P<0.05

2.3 H.pylori感染與SFRPs基因啟動(dòng)子甲基化的相關(guān)性 Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，H.pylori感染與SFRPs基因啟動(dòng)子甲基化間無線性相關(guān)(rs=0.264，P<0.05)。

3 討論

我國胃癌的特點(diǎn)是：(1)發(fā)病率高，我國每年新增胃癌病例約40萬；(2)早期診斷率小于10%；(3)手術(shù)切除率低，總的胃癌手術(shù)切除率為50%～70%；(4)5年生存率低，我國胃癌根治術(shù)后5年生存率為32%～40%。近年來研究表明腫瘤的發(fā)生發(fā)展是基因組學(xué)和表觀遺傳學(xué)共同作用的結(jié)果。表觀遺傳是指DNA序列不發(fā)生變化，但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變[7]，表觀遺傳修飾包括DNA甲基化、組蛋白修飾、microRNA、染色質(zhì)重塑等。DNA甲基化是主要的表觀遺傳學(xué)修飾方式，是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶上[8]。哺乳動(dòng)物基因組DNA甲基化主要位點(diǎn)是CpG島，據(jù)統(tǒng)計(jì)，大于50%的基因啟動(dòng)子區(qū)含有CpG島。啟動(dòng)子區(qū)的CpG島通常處于非甲基化狀態(tài)，使基因得以正常表達(dá)；當(dāng)其發(fā)生甲基化時(shí)，會(huì)影響基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，使基因表達(dá)發(fā)生沉默。

胃癌是一種表觀遺傳學(xué)疾病，DNA甲基化作為一種主要的表觀遺傳學(xué)修飾方式，在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用。Wnt通路中的Wnt蛋白是一種分泌型糖蛋白家族，通過與細(xì)胞表面機(jī)制及特異性Fz受體結(jié)合激活下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、生物發(fā)育、腫瘤形成、細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮了重要的作用，其異?；罨c腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[9]。多種消化道腫瘤存在Wnt信號(hào)通路異常激活。在此通路中，最經(jīng)典的是Wnt-β-catenin-TCF/LEF通路，其通路的拮抗劑有Dickkopf-1、SFRPs、Cerberus、Wnt抑制因子-1(WIF-1)[10]和內(nèi)皮抑素(endostatin)[11]。其中，SFRPs作為Wnt信號(hào)通路的拮抗因子，常由于其啟動(dòng)子CpG島的高甲基化致該基因表達(dá)沉默，而導(dǎo)致結(jié)腸癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌等惡性腫瘤發(fā)生[4]。

SFRPs是能與Wnt直接結(jié)合的分泌型糖蛋白家族系列，定位于8p12-11.1染色體，由SFRPs基因編碼，其蛋白結(jié)構(gòu)中含有半胱氨酸富含區(qū)域(cysteine-rich domain CRD)，此區(qū)域與Fz受體有30%～50%序列相似，能競爭性抑制Fz受體或與Wnt配體直接結(jié)合，當(dāng)其發(fā)生基因沉默時(shí)引起Wnt信號(hào)持續(xù)存在，使β-catenin不能被降解而在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量積聚，從而轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生作用，激活Wnt相關(guān)靶基因，導(dǎo)致細(xì)胞增殖而發(fā)生癌變。目前發(fā)現(xiàn)SFRPs家族的成員有SFRP1、SFRP2、SFRP3、SFRP4、SFRP5等[12]。本結(jié)果結(jié)果顯示，72例胃黏膜病變者中，SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5基因啟動(dòng)子甲基化率分別為47.2%、50.0%、37.5%和41.7%；在異型增生組4者甲基化率分別為29.4%、35.3%、11.8%和23.5%，胃癌組分別為72.5%、75.0%、62.5%和65.0%；而在慢性胃炎組中未檢測到SFRPs基因啟動(dòng)子甲基化；且胃癌組SFRPs基因啟動(dòng)子甲基化率顯著高于慢性胃炎組。

H.pylori是已確認(rèn)的胃癌Ⅰ類致癌原，其感染對(duì)于組織構(gòu)成的損傷是促成因素。由于H.pylori的生長環(huán)境是堿性環(huán)境，當(dāng)感染此菌時(shí)能破壞胃內(nèi)本身正常的消化道黏膜的酸性環(huán)境，使正常的胃黏膜暴露于炎性細(xì)胞、損傷因子、各種致病菌的環(huán)境中，使胃黏膜發(fā)生病理改變，造成胃黏膜損傷，使胃內(nèi)環(huán)境改變并導(dǎo)致一系列損傷反應(yīng)，發(fā)生淺表性胃炎、萎縮性胃炎、胃黏膜上皮的腸上皮化生、異型增生等改變，以致上皮的惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腺癌的發(fā)生[13]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組、慢性胃炎組、異型增生組胃黏膜H.pylori感染率依次增加，且相關(guān)分析顯示H.pylori感染與SFRPs基因啟動(dòng)子甲基化間無線性相關(guān)。H.pylori感染時(shí)啟動(dòng)了癌基因過表達(dá)，還是甲基化后的基因更容易使胃黏膜感染H.pylori，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究探索。胃癌的分子病理基礎(chǔ)也不單單是這兩個(gè)方面就能決定的，它本身就是多基因、多信號(hào)通路及多種細(xì)胞因子共同作用的結(jié)果，但是H.pylori的感染與基因的甲基化并無直接關(guān)系[14]。

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