鋅指轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白KLF4在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義

許明 沈?qū)氒?江青山 周芝芳 唐洪波

·論著·

鋅指轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白KLF4在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義

許明 沈?qū)氒?江青山 周芝芳 唐洪波

目的 檢測(cè)鋅指轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白KLF4在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的分布、表達(dá)及其與臨床特征的關(guān)系。方法 采用免疫組化染色法檢測(cè)并分析KLF4在48例經(jīng)病理確診為喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的分布及表達(dá), 以56例聲帶息肉組織作為對(duì)照。結(jié)果 KLF4蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌及聲帶息肉組織的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí), 高分化鱗癌與低分化鱗癌的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 KLF4可能在喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用, 并且可能主導(dǎo)了腫瘤的分化程度。

鋅指轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白；喉鱗狀細(xì)胞癌；免疫組化；意義

鋅指轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白KLF4是近年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子蛋白, KLF4蛋白基因通過(guò)激活或抑制其上游或下游目的基因的轉(zhuǎn)錄而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡、增殖, 或者被其他因子影響以共同調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄, 最終實(shí)現(xiàn)維持細(xì)胞周期和機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。由于腫瘤的生物學(xué)特征是細(xì)胞的異常增生和分化以及在組織內(nèi)的侵襲性, 因此認(rèn)為KLF4在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能起著調(diào)控作用。本研究采用免疫組化技術(shù)對(duì)48例喉鱗癌組織及56例聲帶息肉組織中KLF4蛋白表達(dá)情況進(jìn)行研究, 以探討KLF4蛋白在喉鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 本研究收集自2003～2008年南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院48例喉鱗癌及56例聲帶息肉手術(shù)存檔及活檢石蠟標(biāo)本, 病例資料完整。所有標(biāo)本均經(jīng)本院病理學(xué)專(zhuān)家閱片2次,確診為喉鱗狀細(xì)胞癌及聲帶息肉。并且所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定, 石蠟包埋, 4 μm連續(xù)切片。

1. 2 試劑 MaxvisionTMHRP-Polymer anti-Rabbit IHC kit(編號(hào)：KIT-5004)、DAB顯色劑(編號(hào)：DAB-0031)、蘇木蘇體C快速染色液(編號(hào)CTS-1099)均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。兔抗人KLF4多克隆抗體(編號(hào)：bs-1064R)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1. 3 方法 采用免疫組化二步法。常規(guī)石蠟切片脫蠟、梯度酒精水化, 檸檬酸沸水加熱抗原修復(fù), 3%雙氧水孵育, PBS沖洗, 加KLF4一抗(按說(shuō)明書(shū)稀釋度為1：1000)室溫孵育1 h后PBS沖洗3次, 滴加MaxvisionTMHRPPolymer anti-Rabbit IHC室溫孵育30 min后PBS沖洗3次, 滴加DAB顯色劑, 目測(cè)顯示棕黃色時(shí)PBS沖洗, 蘇木蘇復(fù)染, 脫水, 中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察并照相。

1. 4 結(jié)果判定 用半定量的方法, 根據(jù)參考文獻(xiàn)［1］的標(biāo)準(zhǔn)及方法判定結(jié)果。選擇切片中具有代表性的區(qū)域, 由2名資深病理醫(yī)師以盲法行免疫組畫(huà)染色觀察并計(jì)算積分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比例和染色強(qiáng)度行半定量積分:無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0 分; 陽(yáng)性細(xì)胞1%～10%為1分; 11%～30%為2分; 31%～50%為3分; 51%～80%為4分; 81%～100%為5分。染色強(qiáng)度: 陰性為0分; 弱陽(yáng)性為1分; 中等陽(yáng)性為2分; 強(qiáng)陽(yáng)性為3分。兩者相乘獲得最終積分, 理論上分值為0～15 分; ≥3分定為陽(yáng)性或高表達(dá); 0～2分為無(wú)陽(yáng)性表達(dá)。

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)分析運(yùn)用SPSS13.0軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn), P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 KLF4蛋白在喉鱗癌組織中的表達(dá) KLF4蛋白陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞, 其著色部位主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi), 見(jiàn)圖1～3。喉鱗狀細(xì)胞癌與聲帶息肉上皮細(xì)胞中KLF4蛋白陽(yáng)性率分別為73%和91%,兩者差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 見(jiàn)表1。

2. 2 KLF4蛋白的表達(dá)與喉癌臨床特征的關(guān)系 KLF4蛋白的表達(dá)與喉癌的組織分化程度有關(guān), 高分化鱗癌與中分化鱗癌的陽(yáng)性率比低分化鱗癌高(P＜0.05), 見(jiàn)表2。

圖1 聲帶息肉高表達(dá)

圖2 高分化鱗癌高表達(dá)

圖3 高分化鱗癌低表達(dá)

表1 KLF4蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌及聲帶息肉上皮細(xì)胞中的表達(dá)

表2 KLF4蛋白的表達(dá)與喉癌臨床特征的關(guān)系

3 討論

鋅指轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白KLF4是近年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子蛋白, 因其首先在小鼠去血清處理的NIH3T3細(xì)胞cDNA文庫(kù)中獲得該基因, 而其表達(dá)主要在胃腸道上皮, 因此也命名為胃腸富集Krupple樣因子。KLF4蛋白基因通過(guò)激活或抑制其上游或下游目的基因的轉(zhuǎn)錄而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡、增殖,或者被其他因子影響以共同調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄, 最終實(shí)現(xiàn)維持細(xì)胞周期和機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。但是到目前為止, 人們對(duì)KLF4的生理功能了解不多?，F(xiàn)已被證實(shí)的其下游能被激活的目的基因有角蛋白4, 角蛋白19, P21WAF1/Cip1、EBV ED-12、γ球蛋白、CD14等基因的啟動(dòng)子, 對(duì)β球蛋白、細(xì)胞色素P450 CYPIA1、細(xì)胞周期素Cyclin D1、P53等基因的啟動(dòng)子則是抑制作用。KLF4蛋白在大多數(shù)消化道惡性腫瘤中的表達(dá)研究已有相關(guān)報(bào)道。在Apc(Min)/(Apc(Min/+))鼠和Apc(Min)/ (Klf4(+/-)/ Apc(Min/+))鼠的腸內(nèi)腺瘤生長(zhǎng)中, KLF4蛋白水平和mRNA水平隨著腫瘤的長(zhǎng)大而下降,表明KLF4在 Apc(Min)突變腸內(nèi)腺瘤生長(zhǎng)過(guò)程中有重要的作用。此外, 在其他腫瘤中, 如子宮內(nèi)膜癌［1］、宮頸鱗癌患者［2］, KLF4的表達(dá)也是下調(diào)的。而在喉鱗癌中KLF4的表達(dá)研究國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本文以KLF4蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)作為研究?jī)?nèi)容, 根據(jù)所查閱絕大部分的相關(guān)文獻(xiàn)判斷蛋白表達(dá)情況標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn), 這樣能較好的反映研究蛋白的表達(dá)情況。

近年來(lái)的研究表明, KLF4蛋白在消化道大部分上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤中的表達(dá)下調(diào), 并且在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。KLF4蛋白基因通過(guò)調(diào)節(jié)其他基因或被其他基因調(diào)節(jié), 從而影響細(xì)胞遺傳信息的改變。目前對(duì)KLF4在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)的機(jī)制還不明確。研究發(fā)現(xiàn), 在手術(shù)切除的結(jié)腸直腸癌標(biāo)本和結(jié)腸直腸癌細(xì)胞株中, 部分標(biāo)本KLF4的開(kāi)放讀碼框有點(diǎn)突變, 這就可能引起了KLF4的表達(dá)下降, 不能有效激活P21(WAF1/Cip1)啟動(dòng)子, 以進(jìn)一步激活P53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［2］, 從而導(dǎo)致不能正常抑制細(xì)胞的增殖以至于造成細(xì)胞的異常增生和腫瘤的形成。此外, 硒元素可以增加KLF4的表達(dá), 并且使用KLF4敲除短期干擾RNA明顯減弱了在DNA合成抑制、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用和三個(gè)KLF4目的基因Cyclin D1, P21/WAF1,和p27/Kip1的表達(dá)中硒的作用效果, 可以引起癌細(xì)胞的繼續(xù)增殖, 因此, KLF4可能通過(guò)KLF4-P21或p27/Kip1-P53的轉(zhuǎn)錄抑制或激活系統(tǒng)來(lái)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)展［3］。

本研究應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)48例喉鱗狀細(xì)胞癌中KLF4的表達(dá)陽(yáng)性率為73%, 在56例聲帶息肉組織中陽(yáng)性表達(dá)率為91%, 兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。喉鱗狀細(xì)胞癌中高分化鱗癌的陽(yáng)性表達(dá)率為85%, 而低分化鱗癌的陽(yáng)性表達(dá)率為(22%), 兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。作者認(rèn)為, KLF4在喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起著重要的作用, 并且隨著喉鱗狀細(xì)胞癌的分化程度的降低其主導(dǎo)腫瘤發(fā)生的作用越大。

［1］ 劉紅. 子宮內(nèi)膜癌組織鋅指蛋白KLF4的表達(dá)及臨床意義. 山東醫(yī)藥, 2005, 45(24):29.

［2］ 劉紅. 胃腸富集Kruppel因子GKLF在宮頸鱗癌中的表達(dá)及意義. 泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2004,25(5): 425-428.

［3］ Hart GT. Kruppel-like factors in lymphocyte biology. J Immunol, 2012,188(2):521-526.

Expression and significance of zinc finger transcription adjection protein in laryngeal squamous cell carcinoma

XU Ming, SHEN Bao-ming, JIANG Qing-shan, et al. Department of Otorhinolaryngology, First Hospital Affiliated to University of South China, Hengyang 421001, China

objective To investigate the relation of distributions and expressions of the zinc finger transcription adjection protein KLF4 with clinical histological characteristics in laryngeal squamous cell carcinoma(LSCC). Methods The distributions and expressions of KLF4 were examined with immunohistochemical staining in 53 specimens which were diagnosed by pathology , and comparing with 44 specimens of polyp of vocal cord(PVC). Results The differences of expressions of KLF4 between LSCC and PVC were statistically significant(P＜0.05).At the same time, the differences between well-differentiated and poolydifferentiated laryngeal squamous cell carcinoma were statistically significant also(P＜0.05). Conclusion KLF4 may play a important role in the generation and evolution of LSCC, and decide the differentiation degree of LSCC.

Zinc finger transcription adjection protein; Laryngeal squamous cell carcinoma; Immunohistochemical staining; Significant

R739.65

A

1674-9316(2013)22-0001-03

10.3969/J.ISSN.1674-9316.2013.22.001

421001 南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科