復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與蛻膜組織中妊娠相關(guān)血漿蛋白A的關(guān)系研究

楊 君，王慧玲，華方方

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是指連續(xù)2次及以上的自然流產(chǎn)，是妊娠期婦女的常見并發(fā)癥之一[1]。目前關(guān)于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因尚不完全清楚，約80%的流產(chǎn)者不存在生殖道感染、解剖、內(nèi)分泌、遺傳和自身免疫功能異常等病因[2]。妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPP-A)是由胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞合成的母體血漿糖蛋白，研究顯示其在早期配子的發(fā)育、受精卵的著床、妊娠的維持以及胎兒和胎盤的生長(zhǎng)發(fā)育等方面均發(fā)揮重要作用[3]。其表達(dá)水平隨著孕周的增加而增高，筆者在臨床工作中發(fā)現(xiàn)PAPP-A水平在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦蛻膜組織中的表達(dá)水平低于正常孕婦，本研究即探討了蛻膜組織中PAPP-A水平與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)之間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料病例入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者染色體檢查正常，無家族性遺傳病史，家族中未出現(xiàn)過自然流產(chǎn)者；(2)患者生殖道感染檢測(cè)呈陰性；(3)抗心磷脂抗體、抗核抗體、抗精子抗體及抗子宮內(nèi)膜抗體檢查均為陰性；(4)無自身免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病等；(5)無心腦血管疾病及其他傳染性疾病病史；(6)配偶生殖系統(tǒng)和精液功能正常；(7)無吸煙、酗酒等不良生活習(xí)慣。選擇2010年6月—2012年6月我院收治的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦39例作為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組(RSA組)，年齡27～41歲，平均(33.1±5.4)歲；孕期5～7周，平均(6.1±0.8)周。選擇同時(shí)期在我院進(jìn)行人工流產(chǎn)的健康早孕婦女30例作為對(duì)照組，年齡23～40歲，平均(32.1±5.2)歲；孕期為5～8周，平均(6.5±0.9)周。兩組受試者的年齡、孕周間具有可比性(t=0.143、0.217,P>0.05)。

1.2實(shí)驗(yàn)材料與儀器蛻膜組織均通過負(fù)壓吸引術(shù)獲得，于液氮中保存使用；Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連寶生物；SYBY Green MiX 購(gòu)自羅氏生物；96孔板購(gòu)自Applied Biosystems；小鼠抗人PAPP-A單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；羊抗鼠二抗購(gòu)自Santa-cruz公司；DAB顯色液購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司；蘇木精購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司；國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；Real-time PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自Applied Biosystems；LEICA RM2245石蠟切片機(jī)購(gòu)自萊卡上海分公司；OLYMPUS BX5l顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1熒光定量PCR(RT-PCR)分析PAPP-A mRNA水平將蛻膜組織從液氮中取出，置于1 ml Trizol試劑中，勻漿后加入200 μl的氯仿，振蕩混勻后冰上放置5 min，12 000 r/min(離心半徑13.5 cm)離心15 min，吸取澄清部分加入等體積異丙醇中，混勻后冰上靜置10 min，12 000 r/min離心15 min，棄上清液，向離心管中加入1 ml預(yù)冷的75%乙醇溶液，輕輕振蕩5下后8 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的溶液溶解，定量后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為RT-PCR的模板。

PAPP-A引物，上游：5′-CTACTTGGATGTTAATGAGC-3′；下游：5′-TCCTGCCAACTCCTCCTCTG-3′。Actin作為內(nèi)參，上游：5′-AGCGGGAAATCGTGCGTGACA-3′；下游：5′-GTGGACTTGGGAGAGGACTGG-3′，由上海英俊生物公司合成。引物合成后稀釋為10 μM。反應(yīng)體系如下：2×SYBR?Premix ExTaqTM 10 μl，上游引物和下游引物各0.6 μl，cDNA模板1∶100稀釋后取8.8 μl，總體積20 μl。按比例配制上述反應(yīng)液后分裝于96孔PCR板，每孔20 μl，然后以1 000 r/min離心2 min。PCR反應(yīng)條件如下：預(yù)變性：95 ℃,30 s；變性：95 ℃,3 s；退火延伸：60 ℃,30 s；構(gòu)建溶解曲線。表達(dá)量的計(jì)算采用ΔΔt模式。

1.3.2免疫組化分析PAPP-A水平將RSA組和對(duì)照組蛻膜組織用石蠟包被，切成5 μm厚的切片，貼于載玻片上進(jìn)行脫蠟處理，結(jié)束后用磷酸鹽吐溫(PBST)緩沖液沖洗3次，用3%過氧化氫-甲醇液浸泡除去內(nèi)源性的過氧化氫酶，PBST緩沖液沖洗3次后將玻片置于檸檬酸緩沖液中，微波加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻至室溫后PBST緩沖液沖洗3次，用10%的山羊血清室溫封閉1 h，然后用10%山羊血清稀釋的一抗工作液4 ℃孵育過夜。次日在室溫回溫1 h后用PBST緩沖液沖洗3次，用二抗工作液室溫孵育30 min,PBST緩沖液沖洗3次后DAB顯色2～10 min，邊顯色邊觀察，著色后用自來水沖洗掉顯色液，蘇木精復(fù)染30 s，然后梯度乙醇脫水并用中性樹脂封固。同時(shí)設(shè)立陰性和陽(yáng)性對(duì)照。陽(yáng)性評(píng)定標(biāo)準(zhǔn):所有切片均采用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像系統(tǒng)分析。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，放大400倍，分析陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例，分為4個(gè)等級(jí)，陰性(-)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%；弱陽(yáng)性(+)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5%～25%；中等陽(yáng)性(++)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)26%～50%；強(qiáng)陽(yáng)性(+++)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%。并采用Motic Med 6.0 數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像系統(tǒng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行定量分析。

2　結(jié)果

2.1RSA組和對(duì)照組蛻膜組織中PAPP-A mRNA水平比較從蛻膜組織中提取的RNA經(jīng)紫外線分析，光密度(OD)260/OD280為1.9～2.0，說明RNA純度較高，未受到DNA和蛋白質(zhì)污染。并采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為RT-PCR的模板。RSA組蛻膜組織中PAPP-A mRNA水平較對(duì)照組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.152,P<0.05，見圖1)。

圖1　RSA組和對(duì)照組蛻膜組織中PAPP-A mRNA水平比較

Figure1Comparison of PAPP-A mRNA between RSA group and control group in basal deciduas tissues

2.2RSA組和對(duì)照組蛻膜組織中PAPP-A水平比較PAPP-A表達(dá)于蛻膜細(xì)胞的胞質(zhì)中(見圖2A)。兩組PAPP-A表達(dá)程度間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(u=4.995，P=0.000),其中RSA組PAPP-A表達(dá)以強(qiáng)陽(yáng)性為主，對(duì)照組主要以弱陽(yáng)性為主(P<0.05，見表1)。對(duì)RSA組和對(duì)照組標(biāo)本進(jìn)行定量分析顯示，RSA組PAPP-A表達(dá)水平較對(duì)照組下降(t=2.591，P<0.05，見圖2B)。

2.3PAPP-A蛋白與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)系以PAPP-A水平、年齡、孕周為自變量，以是否發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)為因變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示PAPP-A水平是導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的危險(xiǎn)因素之一〔b=1.722，OR=5.596，95%可信區(qū)間(2.406，13.017)，P=0.004〕。Hosmer-Lemeshow擬合優(yōu)度檢驗(yàn)結(jié)果顯示PAPP-A水平對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的預(yù)測(cè)具有較好的校準(zhǔn)度(χ2=3.158，P<0.05)。

表1RSA組和對(duì)照組蛻膜組織中PAPP-A的表達(dá)程度比較

Table1Comparison of PAPP-A protein in RSA group and control group in basal deciduas tissues

組別例數(shù)-++++++對(duì)照組30219* 8 1 RSA組390 7 1121*

注：與組內(nèi)其他表達(dá)程度比較，*P<0.05

注：A為PAPP-A的組織分布，B為PAPP-A的水平比較

圖2RSA組和對(duì)照組蛻膜組織中PAPP-A的組織分布及水平比較

Figure2Comparison of PAPP-A protein location and level between RSA group and control group in basal deciduas tissues

3　討論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)占妊娠總數(shù)的1%，給孕婦心理和身體造成了極大的損傷，目前已經(jīng)成為臨床研究的焦點(diǎn)[4]。但復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，包括染色體異常[5]、內(nèi)分泌異常[6]、免疫功能異常[7]、生殖器異常、感染因素[8]、全身性疾病、創(chuàng)傷刺激、不良生活習(xí)慣及環(huán)境因素等。但是約80%的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)沒有明確的病因[9]。近年來，隨著臨床研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)PAPP-A在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦中表達(dá)異常，因此本研究探討了其與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)之間的關(guān)系，旨在為臨床診斷復(fù)發(fā)性流產(chǎn)提供一定的參考價(jià)值。

PAPP-A是與妊娠密切相關(guān)的一類大分子糖蛋白，近年來，研究顯示其在早期胚胎發(fā)育、受精卵著床、妊娠期維持、胎兒和胎盤生長(zhǎng)以及發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[10]。PAPP-A主要由胎盤滋養(yǎng)層合體細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞產(chǎn)生，然后分泌入血，從妊娠后第5周起可在孕婦血清中檢測(cè)到，并隨著孕周的增加其水平逐漸升高，到妊娠末期達(dá)到最高峰，產(chǎn)后水平逐漸下降[11]。目前PAPP-A已成為臨床早孕診斷和胎兒健康程度的主要監(jiān)測(cè)指標(biāo)。筆者在長(zhǎng)期臨床研究中發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦血清中PAPP-A水平明顯低于正常孕婦，這一結(jié)果跟目前部分報(bào)道一致[12]。

本研究顯示，與對(duì)照組比較，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦蛻膜組織中PAPP-A mRNA的水平明顯下降；為了進(jìn)一步分析PAPP-A水平，采用免疫組化的方法分析了蛻膜組織中PAPP-A的表達(dá)變化，結(jié)果顯示復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦蛻膜組織中PAPP-A水平明顯低于對(duì)照組，蛻膜組織中PAPP-A的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致了入血的PAPP-A水平下降，所以表現(xiàn)為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦血清中PAPP-A水平低于對(duì)照組孕婦。進(jìn)一步行Logistic回歸分析顯示PAPP-A水平下調(diào)是導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的危險(xiǎn)因素，提示其在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診斷中具有較好的準(zhǔn)確性。

綜上所述，PAPP-A在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)蛻膜組織中表達(dá)水平明顯下調(diào)，其下調(diào)是導(dǎo)致發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的原因之一。

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