北極狐ESR基因多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)關(guān)聯(lián)分析

黃 賀，田亞光，鄭 鵬，李和平

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030; 2.東北林業(yè)大學(xué) 野生動(dòng)物資源學(xué)院，哈爾濱150040)

利用常規(guī)方法對(duì)北極狐的繁殖性狀進(jìn)行選擇，進(jìn)展比較緩慢。尋找與北極狐產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，利用分子標(biāo)記輔助選擇與常規(guī)選擇相結(jié)合的方法，能夠有效地提高對(duì)北極狐繁殖性狀的選擇進(jìn)展，從而加快北極狐的育種進(jìn)展。雌激素受體(estrogen receptor，ESR) 是一種配體激活轉(zhuǎn)錄因子家族中的一種核酸受體，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白質(zhì)的功能，影響著雌激素基因在雌性脊椎動(dòng)物組織的表達(dá)與調(diào)控。結(jié)合了配體的ESR 與特定的DNA 序列，如雌激素應(yīng)答元件(ESRE)相互作用可以改變雌激素基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響雌性第二性征、繁殖周期、生殖力、妊娠維持，在胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育中也起重要作用［1］。人的ESR 基因由8 個(gè)外顯子和7 個(gè)內(nèi)含子組成，長(zhǎng)為140 kb，編碼595 個(gè)氨基酸，cDNA 長(zhǎng)2.1 kb，ESRα 蛋白質(zhì)約為66 KD。1991年，Rothschild［2］首先將ESR 是第一個(gè)候選基因?qū)ωi的產(chǎn)仔性狀進(jìn)行研究，報(bào)道豬ESR 位點(diǎn)的PvuⅡ多態(tài)性。Rothschild等［3～6］對(duì)位于1 號(hào)染色體上的ESR 基因進(jìn)行RFLP 分析。結(jié)果表明，PvuII 酶切位點(diǎn)的一個(gè)有利等位基因B 與高窩產(chǎn)仔數(shù)有關(guān)，BB型母豬第一胎產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)均高于AA型(P ＜0.01) 。說(shuō)明ESR 基因與產(chǎn)仔數(shù)主效基因緊密連鎖。陳克飛等［7］對(duì)7 個(gè)不同豬種的ESR 基因研究發(fā)現(xiàn)，所有豬種的優(yōu)勢(shì)基因均為B 等位基因，B 等位基因?qū)偖a(chǎn)仔數(shù)和活產(chǎn)仔數(shù)的影響極顯著(P ＜0.01) ，ESR 的BB 基因型個(gè)體為高產(chǎn)仔數(shù)理想個(gè)體。Vrtkova 等［8］認(rèn)為ESR-PvuⅡ酶切多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)呈強(qiáng)相關(guān)。畢曉丹等［9］對(duì)小尾寒羊ESR 的第一外顯子片段進(jìn)行PCR-SSCP 分析發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，B 等位基因與綿羊高產(chǎn)羔數(shù)呈正相關(guān)。涂小璐等［10］對(duì)皖西白鵝ESR 的部分外顯子片段進(jìn)行克隆分析，發(fā)現(xiàn)第一外顯子存在一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，認(rèn)為B 等位基因是高產(chǎn)蛋量有利基因。ESR 基因在動(dòng)物繁殖過(guò)程中起重要作用，其多態(tài)性與北極狐繁殖性狀關(guān)聯(lián)是研究的熱點(diǎn)。產(chǎn)仔數(shù)是養(yǎng)狐業(yè)的一個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)性狀，提高產(chǎn)仔數(shù)可以減少種狐飼養(yǎng)數(shù)量，降低生產(chǎn)成本，增加皮張產(chǎn)量，給養(yǎng)狐業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益。同時(shí)，提高產(chǎn)仔數(shù)也是北極狐育種工作的主要目標(biāo)。運(yùn)用現(xiàn)代分子生物技術(shù)將其在繁殖性能方面的優(yōu)勢(shì)挖掘出來(lái)，進(jìn)而通過(guò)標(biāo)記輔助保種、選育等方法將其推廣于現(xiàn)代北極狐生產(chǎn)當(dāng)中，將會(huì)給養(yǎng)狐業(yè)帶來(lái)巨大的收益。目前，關(guān)于北極狐ESR 基因多態(tài)性方面的研究甚少。本試驗(yàn)旨在發(fā)現(xiàn)北極狐在繁殖方面的遺傳優(yōu)勢(shì)，在北極狐群中利用分子標(biāo)記輔助選擇的方法提高其產(chǎn)仔數(shù)打下基礎(chǔ)，并為北極狐遺傳資源的保護(hù)和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選取哈爾濱松北養(yǎng)狐場(chǎng)的具有完整產(chǎn)仔記錄的北極狐233 只，整理2008 ～2011年的母群生產(chǎn)檔案，共871 窩產(chǎn)仔記錄。

1.2 樣品采集

采集帶毛囊的針毛作為試驗(yàn)材料，置于含有70% 乙醇的1.5 mL 離心管中，于-20 ℃保存?zhèn)溆?/p>

1.3 基因組DNA 的提取

采用酚/氯法提取毛囊組織中的基因組DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取物的質(zhì)量，經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量，并將提取物稀釋至50 ng·μL-1，-20 ℃保存。

1.4 引物設(shè)計(jì)及PCR 擴(kuò)增

在北極狐ESR 基因exon1 區(qū)域各設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物用于PCR 擴(kuò)增(引物由北京英駿生物技術(shù)有限公司合成) 。序列為F: 5'-CGGAGACACGCTGTT GAGC- 3'，R: 5'-ATTACCTGGAGAACGAGCCG-3'。加滅菌雙蒸水將引物溶解至濃度為10 μmol·L-1，4 ℃保存。采用PCR 技術(shù)擴(kuò)增ESR 基因的片段，其反應(yīng)體系為25 μL，其中包括: 10 ×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl21.5 μL，10 mmol·L-1dNTP Mix 2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)0.2 μL，DNA 模板(25 ng·μL-1) 2 μL，滅菌雙蒸水加至25 μL。PCR 反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min; 95 ℃變性30 s、61 ℃退火45 s、72 ℃延伸45 s，28 個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸7 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物位置及大小如表1 所示。

表1 PCR 產(chǎn)物位置及大小

1.5 SSCP 檢測(cè)

將5 μL PCR 產(chǎn)物和5 μL 上樣緩沖液混合，98 ℃變性10 min，迅速冰浴10 min。樣品在14%非變性聚丙烯酰胺凝膠中4 ℃條件下電泳過(guò)夜。電泳結(jié)束后，進(jìn)行銀染顯色和單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP) 分析。

1.6 PCR 產(chǎn)物的克隆和測(cè)序

將PCR 產(chǎn)物在15 g·L-1瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)并回收，在測(cè)序儀上雙向測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交BLAST 網(wǎng)站進(jìn)行比較，確定突變的位置和類型。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

計(jì)算基因頻率、基因型頻率、多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)、群體雜合度和χ2值，方法參見(jiàn)文獻(xiàn)［11，12］。根據(jù)影響北極狐繁殖性能的因素，采用SAS 軟件，配合下列模型進(jìn)行最小二乘方差分析，比較北極狐的總產(chǎn)仔數(shù)(TNB) 、產(chǎn)活仔數(shù)(NBA) 在各基因型之間的差異。線性混合模型為Yijklm=u +Mi+Gj+Sek+Sil+eijklm，其中Yijklm: 繁殖性狀的數(shù)值，u: 群體平均值; Mi: 第i 個(gè)胎次的固定效應(yīng); Gj: 第j 種基因型的固定效應(yīng);Sek為季節(jié)固定效應(yīng); Sil為公狐隨機(jī)效應(yīng);eijklm: 隨機(jī)殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 SSCP 檢測(cè)與序列分析

對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)多態(tài)座位，且均出現(xiàn)3 種基因型，分別定義為AA、BB 和AB(圖1) 。

對(duì)該基因的核苷酸序列進(jìn)行雙向測(cè)序分析表明，ESR 基因存在2 種等位基因，分別命名為等位基因A 和B。序列比對(duì)表明，ESR 多態(tài)的產(chǎn)生是由ESR 基因序列第539 位G→C 突變?cè)斐傻摹?/p>

圖1 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP 分析

2.2 多態(tài)座位基因頻率及基因型頻率的統(tǒng)計(jì)分析

利用PCR-SSCP 方法進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，分型后計(jì)算多態(tài)座位的基因型頻率和基因頻率(表2) 。由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，在北極狐中，ESR 多態(tài)座位以A 為優(yōu)勢(shì)等位基因，基因頻率為0.54。

2.3 ESR 基因群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

ESR 基因在群體中的遺傳純和度、遺傳雜合度、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量結(jié)果見(jiàn)表3。由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，北極狐群體的多態(tài)信息含量小于0.25，純和度大，說(shuō)明該群體在這個(gè)基因座位的遺傳變異小。在此座位上北極狐群體處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)。

2.4 ESR 基因多態(tài)性與北極狐產(chǎn)仔性狀的關(guān)聯(lián)分析

利用SAS(Version 8.02) 軟件的MIXED程序?qū)Χ鄳B(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析(表4) 。

對(duì)于初產(chǎn)母狐，BB 基因型母狐的TNB和NBA 比AA 基因型母狐分別多2.61 頭和1.25 頭(P ＜0.05) ; 對(duì)于經(jīng)產(chǎn)母狐，BB 基因型母狐的TNB 和NBA 比AA 基因型母狐分別多2.08 頭和1.29 頭(P ＜0.05) 。3 種基因型個(gè)體TNB 和NBA 的總體趨勢(shì)為: BB＞AB ＞AA。

表2 ESR 基因兩個(gè)多態(tài)座位的基因型頻率和基因頻率

表3 ESR 基因多態(tài)座位的遺傳多態(tài)參數(shù)

表4 不同基因型對(duì)產(chǎn)仔性狀的效應(yīng)

3 討論

關(guān)于ESR 基因多態(tài)性，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)研究，試圖尋找ESR 基因變異中有利于提高母畜繁殖潛能的有利基因和優(yōu)勢(shì)基因型。國(guó)內(nèi)外一些研究者發(fā)現(xiàn)ESR 基因與總產(chǎn)仔數(shù)/活產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān)。Rothschild等［13］對(duì)ESR 基因進(jìn)行RFLP 分析，檢測(cè)含50%梅山豬血的兩個(gè)合成系161 頭母豬ESR基因的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)一個(gè)特異的3.7 kb 帶，命名為等位基因B，并與高窩產(chǎn)仔數(shù)有關(guān)。BB 基因型母豬初產(chǎn)產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)比AA基因型母豬高2.3 頭(P ＜0.01) ，全部胎次高1.5 頭(P ＜0.01) 。Short 等［14］采用PCR-RFLP 技術(shù)檢測(cè)ESR 的基因型，以PIC 公司4 263 頭母豬的9 015 窩產(chǎn)仔記錄為研究對(duì)象，結(jié)果表明，BB 基因型母豬比AA 基因型母豬初產(chǎn)產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)分別多0.91頭和0.80 頭，經(jīng)產(chǎn)的均多0.68 頭。國(guó)內(nèi)的學(xué)者對(duì)ESR 基因進(jìn)行了廣泛和深入的研究。大部分研究認(rèn)為，B 等位基因提高了國(guó)外豬種與中國(guó)地方豬種的產(chǎn)仔數(shù)［15～20］。因此，可以用于育種實(shí)踐以改良豬的產(chǎn)仔數(shù)。而有研究表明，該位點(diǎn)與母豬繁殖性能之間的相關(guān)性不高［21，22］; 也有研究表明，A 等位基因在繁殖性能上具有優(yōu)勢(shì)效應(yīng)［23，24］。這些差異可能與豬的品種、飼養(yǎng)水平、樣本量及環(huán)境不同有關(guān)。張淑君等［25］對(duì)二花臉豬的研究結(jié)果表明，二花臉豬的基因B 的頻率極高(0.85) ，大白豬和長(zhǎng)白豬的B 基因頻率分別為0.47 和0.16，這個(gè)結(jié)果與Rothschild 等的研究結(jié)果相一致，即B 基因頻率與產(chǎn)仔數(shù)呈正相關(guān)。李千軍等［26］對(duì)ESR 基因多態(tài)性與母豬的繁殖性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明，長(zhǎng)白豬的ESR 基因的優(yōu)勢(shì)基因是A，初產(chǎn)母豬BB 基因型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)均顯著高于AA 基因型個(gè)體，經(jīng)產(chǎn)與初產(chǎn)相反;大白豬的ESR 基因的優(yōu)勢(shì)基因是A，初產(chǎn)母豬AA 基因型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)均顯著高于BB 基因型個(gè)體，在經(jīng)產(chǎn)母豬中，ESR 基因BB 基因型高于AA 型個(gè)體總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)高。畢曉丹等［27］對(duì)綿羊的ESR基因第1 外顯子部分序列進(jìn)行PCR- SSCP分析，以高繁殖力的小尾寒羊、湖羊、德國(guó)肉用美利奴羊和低繁殖力的多賽特羊、薩?？搜?yàn)檠芯繉?duì)象，在小尾寒羊、湖羊和德國(guó)肉用美利奴羊中檢測(cè)到AA、AB 和BB 三種基因型，在多賽特羊和薩?？搜蛑袡z測(cè)到AA 和AB 兩種基因型，通過(guò)純合子測(cè)序發(fā)現(xiàn)，BB 基因型和AA 基因型個(gè)體在外顯子1的第363 位點(diǎn)存在一個(gè)C→G 單堿基變異。在小尾寒羊中，AB 基因型個(gè)體和BB 基因型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)比AA 基因型分別高0.51 只和0.70 只(P ＜0.05) ，因此認(rèn)為，ESR 基因可能是一個(gè)與小尾寒羊多胎性能有關(guān)的一個(gè)主效基因或與其緊密的遺傳連鎖。石照應(yīng)等［28］對(duì)貴州小香羊ESR 基因外顯子1 的多態(tài)性研究表明，貴州小香羊ESR 基因外顯子1 的SSCP 呈現(xiàn)一種帶型，命名為AA 基因型(野生型) ，不存在多態(tài)性。本研究發(fā)現(xiàn)北極狐ESR 基因的基因型頻率AA ＞AB ＞BB，等位基因頻率A ＞B，北極狐的優(yōu)勢(shì)等位基因是A 等位基因，BB 是理想基因型，AA 基因型與BB 基因型在第539 bp 處出現(xiàn)1 個(gè)G→C的單堿基變異，使BB 基因型個(gè)體的產(chǎn)仔數(shù)高于AA 基因型個(gè)體。本研究結(jié)果和畢曉丹等的研究結(jié)果較為一致，表現(xiàn)為帶有C 堿基的個(gè)體產(chǎn)仔數(shù)較多，而帶有G 堿基的個(gè)體產(chǎn)仔數(shù)較少，ESR 基因第1 外顯子的多態(tài)性與產(chǎn)仔性狀存在遺傳相關(guān)，ESR 基因可能是控制北極狐產(chǎn)仔性狀的一個(gè)主效基因或是與主效基因緊密連鎖，能夠?qū)SR 基因作為北極狐高產(chǎn)仔性狀的一個(gè)分子標(biāo)記。

母狐年齡是影響多產(chǎn)性的一個(gè)重要因素。在本研究中，ESR 基因?qū)δ负醍a(chǎn)產(chǎn)仔數(shù)的影響高于經(jīng)產(chǎn)。陳克飛等［29，30］對(duì)ESR和FSHβ 的研究中也發(fā)現(xiàn)類似的趨勢(shì)。原因可能是ESR 在胚胎、乳腺和雌性繁殖周期中對(duì)卵泡生長(zhǎng)和發(fā)育起重要作用。初產(chǎn)母狐年齡較小，生殖器官未達(dá)到生殖的最佳時(shí)期，而此時(shí)參與母畜生殖器官發(fā)育的ESR 的mRNA 表達(dá)量高，激素產(chǎn)生量多，所以對(duì)產(chǎn)仔數(shù)的影響效應(yīng)比較大; 而經(jīng)產(chǎn)母狐生殖器官發(fā)育成熟，處在生殖和生產(chǎn)的最佳階段，ESR 的分泌逐漸趨于穩(wěn)定狀態(tài)，表達(dá)量比較低，所以對(duì)產(chǎn)仔數(shù)的影響效應(yīng)小，但要徹底弄清該問(wèn)題，還有待于從蛋白表達(dá)方面做進(jìn)一步研究。

雖然ESR 基因?qū)δ负敝承阅苡酗@著影響，但結(jié)果并不一致。盡管對(duì)繁殖性狀主基因的研究，有利于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)繁殖性狀的遺傳機(jī)理，加快繁殖性狀的改良速度，但影響繁殖性狀的因素很多，在利用主基因進(jìn)行改良時(shí)，也應(yīng)綜合考慮其它遺傳因素對(duì)繁殖性狀的影響。所以能否將ESR 基因作為影響北極狐繁殖性能的主基因或候選基因來(lái)進(jìn)行應(yīng)用，今后的工作還需要通過(guò)擴(kuò)大樣本的數(shù)量做深入的研究。同時(shí)，要記錄不同個(gè)體的經(jīng)濟(jì)性狀，為進(jìn)一步分析基因多態(tài)性與北極狐繁殖性狀的關(guān)系提供更有說(shuō)服力的依據(jù)與參考。

4 結(jié)論

在北極狐中，ESR 基因A 等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)基因; BB 基因型初產(chǎn)母狐和經(jīng)產(chǎn)母狐的TNB 和NBA 顯著高于AA 基因型母狐; 3 種基因型個(gè)體TNB 和NBA 的總體趨勢(shì)為: BB＞AB ＞AA。

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