ATR激酶在紫外線損傷應(yīng)答中的作用

戴仕奎，洪澤輝

(1.東南大學(xué)生命科學(xué)研究院，江蘇南京 210009;2.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)系，江蘇南京 210009)

DNA作為細(xì)胞生命活動最重要的遺傳物質(zhì)，保持其分子結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性對于細(xì)胞的存活和正常生理功能的發(fā)揮具有重要意義。環(huán)境因素以及細(xì)胞內(nèi)源性的一些因子都會對細(xì)胞內(nèi)DNA造成損傷。如果DNA損傷不及時修復(fù)，就會造成DNA突變、基因表達(dá)異常、細(xì)胞周期受阻等，從而引起細(xì)胞凋亡或癌變[1-2]。共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因蛋白(ataxia telangiectasia mutated，ATM)、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因Rad3相關(guān)蛋白(ataxia telangiectasia mutated and Rad3 related protein，ATR)和DNA依賴蛋白激酶催化亞基(DNA dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs)都是DNA損傷后激活細(xì)胞應(yīng)答的重要激酶。這3種激酶參與不同類型的DNA損傷修復(fù)，DNA-PKcs主要參與DSBs修復(fù);而ATM和ATR參與多種DNA損傷應(yīng)答，在功能上存在一定程度的互補(bǔ)，對復(fù)制期DNA的穩(wěn)定起著關(guān)鍵性作用。

由紫外線輻射造成的DNA損傷是最常見的一種損傷形式。在紫外線照射下，嘧啶脫氧核苷酸會產(chǎn)生畸變，主要形成嘧啶二聚體(cyclobutyl pyrimidine dimmers，CPDs)和 6-4 光產(chǎn)物((6-4)photoproduct，6-4PP)。紫外線損傷應(yīng)答(UV damage response)是紫外線照射引起DNA損傷后細(xì)胞激活一系列反應(yīng)修復(fù)DNA損傷或激活凋亡的過程，包括核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair，NER)、細(xì)胞凋亡(apoptosis)、細(xì)胞周期檢測點(diǎn)(cell cycle checkpoint)激活等。ATR是紫外線損傷應(yīng)答中最重要的激酶[3-4]。

1 ATR結(jié)構(gòu)與功能

ATR是300 kDa大小的蛋白，根據(jù)其功能分為ATRIP結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ATRIP-interacting domain)、激酶結(jié)構(gòu)域(kinase domain)等結(jié)構(gòu)域[5-6](圖1)。N 端的ATRIP結(jié)合結(jié)構(gòu)域是ATR激活的重要結(jié)構(gòu)域，C端的激酶結(jié)構(gòu)域是ATR磷酸化下游蛋白重要結(jié)構(gòu)域。ATR是磷酸肌醇-3激酶相關(guān)激酶(phosphatidylinositol 3-kinase related kinase，PIKK)蛋白家族成員，具有將靶蛋白的絲氨酸或蘇氨酸磷酸化功能。在細(xì)胞生長代謝、DNA損傷修復(fù)等過程有重要的作用，其激酶區(qū)序列與磷酸肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI-3K)家族蛋白有很高的相似性。ATR參與DNA損傷修復(fù)類型比ATM更加廣泛，對復(fù)制期DNA的穩(wěn)定起著關(guān)鍵性作用。ATR可以感知紫外線引起的損傷，磷酸化下游的蛋白，如p53、Chk1、claspin等，從而調(diào)控核苷酸切除修復(fù)、細(xì)胞周期以及細(xì)胞的凋亡。

圖1 ATR結(jié)構(gòu)域示意圖(來自文獻(xiàn)[5])Fig 1 A sketch map of ATR domain

2 ATR參與紫外線損傷應(yīng)答的基本機(jī)制

2.1 ATR 的激活

紫外線照射引起DNA損傷，參與核苷酸切除修復(fù)的蛋白會一步一步聚集到損傷位點(diǎn)(見下述NER過程)，RPA蛋白復(fù)合體結(jié)合到損傷位點(diǎn)以保護(hù)完整的那條DNA單鏈時，RPA會與ATRIP和RAD17復(fù)合體結(jié)合，ATR通過N端的ATRIP結(jié)合結(jié)構(gòu)域與ATRIP相互結(jié)合，所以ATR會隨著ATRIP結(jié)合到損傷位點(diǎn)。緊接著RFC復(fù)合體(RFC1-5)聚集到該位點(diǎn)上，Rad17會置換RFC1蛋白[7]，Rad17-RFC2-5復(fù)合體招募9-1-1復(fù)合體(RAD9-HUS1-RAD1)，之后，RAD9會被磷酸化，使得整個復(fù)合體結(jié)構(gòu)變化產(chǎn)生一個TopBP1結(jié)合位點(diǎn)，則TopBP1結(jié)合到該復(fù)合體上，TopBP1作為ATR輔助激活因子將 ATR 激活[5，8-9]。Overmeer 等[10]認(rèn)為，ATR的激活需要XPF將嘧啶二聚體5'端的DNA切開;但Ward等[11]研究認(rèn)為，紫外線誘導(dǎo)產(chǎn)生的損傷修復(fù)產(chǎn)生的ssDNA不足以激活A(yù)TR。在紫外線照射后，只有處在復(fù)制期的細(xì)胞才發(fā)現(xiàn)ATR聚集在染色質(zhì)上，ATR會聚集在停滯復(fù)制叉的ssDNA處，從而激活A(yù)TR，緊接著將H2AX和Chk1磷酸化，激活下游蛋白，磷酸化的H2AX促進(jìn)ATR保持激活狀態(tài)，使ATR穩(wěn)定結(jié)合在ssDNA處。

2.2 ATR參與紫外線損傷應(yīng)答的基本機(jī)制(圖2)

ATR參與紫外線損傷應(yīng)答主要是調(diào)控核苷酸切除修復(fù)、細(xì)胞檢測點(diǎn)的激活以及細(xì)胞凋亡信號通路。

2.2.1 ATR調(diào)控核苷酸切除修復(fù)

圖2 ATR在紫外線損傷應(yīng)答中的作用Fig 2 A sketch map of ATR kinas function in repair of UV-induced DNA damage

核苷酸切除修復(fù)是修復(fù)紫外線引起的DNA畸變的主要方式。核苷酸切除修復(fù)主要分為全基因組核苷酸切除修復(fù)(global genome nucleotide excision repair，GG-NER)和轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)核苷酸切除修復(fù)(transcriptioncoupled nucleotide excision repair，TC-NER)[12]。GGNER主要是執(zhí)行全基因組的修復(fù)，而TC-NER主要是發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄過程中的一種快速修復(fù)方式。GGNER的過程主要有四步:(1)XPC-hHR23B蛋白復(fù)合物識別嘧啶二聚體。(2)TFIIH復(fù)合物解旋嘧啶二聚體處的DNA雙鏈。(3)ERCCl-XPF復(fù)合物和XPG分別切除嘧啶二聚體5'端和3'端的3'-5'磷酸二酯鍵，造成24-32個核苷酸缺口。(4)DNA聚合酶ε和δ在PCNA協(xié)助下合成新的DNA片段，最后LIG1連接酶連接，完成整個修復(fù)過程。TC-NER與GG-NER的區(qū)別在于起始的識別機(jī)制不同，識別過程是依賴于RNA聚合酶的作用[12]。已有研究表明，ATR可以通過調(diào)控著色性干皮病蛋白A(xeroderma pigmentosum group A，XPA)的核質(zhì)分布和p21的泛素化參與核苷酸切除修復(fù)。

2.2.1.1 ATR調(diào)控XPA核質(zhì)分布 XPA是核苷酸切除修復(fù)中的一個重要的參與蛋白，人體細(xì)胞中缺失XPA會造成著色性干皮病(xeroderma pigmentosum)[13-14]，XPA是一個32 kDa含鋅的金屬蛋白。核苷酸切除修復(fù)中，hR23B、DDB2、XPC這些蛋白識別損傷位點(diǎn)后，XPA同RPA、TFⅡH一起結(jié)合到損傷位點(diǎn)，XPA能夠招募下游參與核苷酸切除修復(fù)的蛋白結(jié)合到損傷位點(diǎn)，從而促進(jìn)修復(fù)的進(jìn)行。

Auclair等[15]研究發(fā)現(xiàn)，ATR沉默或缺陷會影響S期細(xì)胞的核苷酸切除修復(fù)。正常的細(xì)胞中，XPA在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都存在，但核質(zhì)中的含量隨著細(xì)胞周期的變化而變化，在G1、S期細(xì)胞質(zhì)中較多，而G2期細(xì)胞核中較多[16]。在 S期，紫外線照射引起的 DNA損傷使 ATR激活，激活的 ATR與 XPA結(jié)合[17]，將XPA磷酸化，促進(jìn)XPA進(jìn)入細(xì)胞核，參與核苷酸切除修復(fù)[18]。Chk1和p53是ATR下游重要的調(diào)控蛋白，XPA進(jìn)入細(xì)胞核，也依賴p53 S15位的磷酸化[16]。

2.2.1.2 ATR調(diào)控p21泛素化修飾 p21是一個分子量為21 kDa的蛋白質(zhì)，是細(xì)胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑家族中的重要成員，是協(xié)調(diào)細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、修復(fù)的重要蛋白。

p21同PCNA相互結(jié)合，抑制PCNA結(jié)合到DNA上，從而影響核苷酸切除修復(fù)。低劑量的紫外線照射(＜40 J·m－2)時，激活的ATR會調(diào)控Skp2這個E3泛素連接酶的作用(但也有研究認(rèn)為p21的降解依賴CRL4cdt2)，將p21泛素化，使p21被蛋白酶體降解，促使PCNA解離出來，結(jié)合到損傷的DNA上，參與核苷酸切除修復(fù)[高劑量紫外線照射(＞40 J·m－2)造成細(xì)胞DNA損傷過多，細(xì)胞會直接啟動凋亡，此時p21不會被泛素化降解]。但ATR調(diào)控p21泛素化修飾的具體途徑目前還了解的不是很清楚，有可能還有其他蛋白參與這一過程，有待深入研究[19-21]。

2.2.2 ATR調(diào)控細(xì)胞周期

增殖狀態(tài)的真核細(xì)胞周期分為 G1、S、G2、M 4個時期，由細(xì)胞周期蛋白(cyclinA、B、C、D等)和細(xì)胞周期依賴激酶(cyclin dependent kinases，CDKs)這兩類蛋白家族來調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程[22-23]，當(dāng)處在應(yīng)激狀態(tài)或者其他一些不利于細(xì)胞周期進(jìn)行的情況時，這兩類蛋白家族蛋白根據(jù)所處的細(xì)胞周期啟動G1/S、S、G2/M、有絲分裂中期相應(yīng)的檢測點(diǎn)。

紫外線輻射引起DNA損傷后，激活的ATR將Chk1、p53磷酸化，隨后 Chk1將 Cdc25A磷酸化，Cdc25A抑制cyclinA的表達(dá)，抑制其與CDK2相互結(jié)合，激活了G1/S和S/G2期細(xì)胞周期檢測點(diǎn)，抑制細(xì)胞周期的進(jìn)行。Chk1還可以將Cdc25C在S216位置磷酸化，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，14-3-3蛋白復(fù)合體結(jié)合到磷酸化的Cdc25C上，隨后Cdc25C/14-3-3復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，抑制Cdc2的磷酸化，從而激活G2/M細(xì)胞周期檢測點(diǎn)[24]。

2.2.3 ATR調(diào)控紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是維持生物體微環(huán)境的重要調(diào)控方式，細(xì)胞在受到損傷無法修復(fù)的情況下啟動凋亡程序，將受損細(xì)胞凋亡，以保護(hù)個體。紫外線誘導(dǎo)的凋亡的途徑可以分為p53非依賴性凋亡與p53依賴性凋亡。p53非依賴性凋亡有3種途徑:紫外線照射誘導(dǎo)細(xì)胞膜上的死亡配體(death ligand)釋放或者表達(dá)增加，同死亡受體(death receptor)結(jié)合增加，激活凋亡;紫外線照射直接使細(xì)胞膜上的死亡受體聚集，不需要死亡配體存在的情況時，激活凋亡;紫外線照射引起線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放，激活凋亡途徑[25]。

紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要通過p53依賴性途徑，受ATR調(diào)控:紫外線損傷后，ATR被激活，將p53磷酸化，使得p53與MDM2解離開，抑制p53被泛素化降解。當(dāng)DNA損傷無法修復(fù)時，磷酸化的p53可以將Apaf1激活，Apaf1將caspase9剪切激活，緊接著caspase9將caspase3剪切激活，caspase3作為凋亡的效應(yīng)蛋白使得細(xì)胞凋亡，同時p53也可以抑制線粒體細(xì)胞色素C激活的凋亡途徑[26]。但 Heffernan 等[27]卻在人角質(zhì)形成細(xì)胞(human keratinocyte)中發(fā)現(xiàn)，ATR通過磷酸化Chk1，從而調(diào)控由紫外線引起的細(xì)胞凋亡，p53并沒有參與。說明ATR可能磷酸化Chk1或p53來調(diào)控細(xì)胞的凋亡，但ATR通過Chk1調(diào)控細(xì)胞凋亡的具體過程尚未闡明，有待進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié) 語

過去的十幾年間，ATR在維持基因組穩(wěn)定性的研究上取得了巨大的進(jìn)展。ATR參與紫外線損傷應(yīng)答也有了很多新的發(fā)現(xiàn):ATR能夠調(diào)控細(xì)胞周期監(jiān)測點(diǎn)的激活，同時也能夠激活細(xì)胞的凋亡。但ATR怎樣協(xié)調(diào)和選擇這兩個途徑的激活、進(jìn)行，同時會不會調(diào)控其他蛋白參與紫外線損傷應(yīng)答，都不是很清楚，有待深入研究。

非黑色素瘤皮膚癌是指基層細(xì)胞瘤以及鱗片細(xì)胞瘤，是白種人最常見的惡性腫瘤，全球該腫瘤發(fā)病率在不斷上升中，這與人口老齡化以及陽光輻射增加有直接的關(guān)系。我國香港地區(qū)的調(diào)查也發(fā)現(xiàn)非黑色素瘤皮膚癌發(fā)病率在不斷的上升[28]。有多項(xiàng)研究表明經(jīng)常飲用茶或者咖啡會降低非黑色素瘤皮膚癌發(fā)生的概率，這是由于咖啡和茶中含有咖啡因，能夠抑制ATR的功能，促進(jìn)紫外線照射引起損傷的細(xì)胞凋亡，從而降低了該皮膚癌的發(fā)生概率[27]。目前，我國的皮膚癌發(fā)病率呈上升趨勢[29]，因此，對于ATR在紫外線損傷應(yīng)答中的功能，以及ATR抑制劑的研究對皮膚癌的治療有著重要的意義。

[1] HANAWALT P C.Subpathways of nucleotide excision repair and their regulation[J].Oncogene，2002，21(58):8949-8956.

[2]江潔，洪澤輝.SSRP1基因的克隆及其參與DNA損傷應(yīng)答的初步研究[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2011，30(6):865-868.

[3]BOMGARDEN R D，LUPARDUS P J，SONI D V，et al.Opposing effects of the UV lesion repair protein XPA and UV by-pass polymerase eta on ATR checkpoint signaling[J].EMBO J，2006，25(11):2605-2614.

[4]ABRAHAM R T.Cell cycle checkpoint signaling through the ATM and ATR kinases[J].Genes Dev，2001，15(17):2177-2196.

[5]SHIOTANI B，ZOU L.ATR signaling at a glance[J].J Cell Sci，2009，122(3):301-304.

[6] LEMPIAINEN H，HALAZONETIS T D.Emerging common themes in regulation of PIKKs and PI3Ks[J].EMBO J，2009，28(20):3067-3073.

[7]CIMPRICH K A，CORTEZ D.ATR:an essential regulator of genome integrity[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9(8):616-627.

[8]ZOU L，ELLEDGE S J.Sensing DNA damage through ATRIP recognition of RPA-ssDNA complexes[J].Science，2003，300(5625):1542-1548.

[9]KUMAGAI A，LEE J，YOO H Y，et al.TopBP1 activates the ATR-ATRIP complex[J].Cell，2006，124(5):943-955.

[10]OVERMEER R M，MOSER J，VOLKER M，et al.Replication protein A safeguards genome integrity by controlling NER incision events[J].J Cell Biol，2011，192(3):401-415.

[11]WARD I M，MINN K，CHEN J.UV-induced ataxia-telangiectasia-mutated and Rad3-related(ATR)activation requires replication stress[J].J Biol Chem，2004，279(11):9677-9680.

[12]FOUSTERI M，MULLENDERS L H.Transcription-coupled nucleotide excision repair in mammalian cells:molecular mechanisms and biological effects[J].Cell Res，2008，18(1):73-84.

[13]PARK C J，CHOI B S.The protein shuffle.Sequential interactions among components of the human nucleotide excision repair pathway[J].FEBS J，2006，273(8):1600-1608.

[14]RIEDL T，HANAOKA F，EGLY J M.The comings and goings of nucleotide excision repair factors on damaged DNA[J].EMBO J，2003，22(19):5293-5303.

[15]AUCLAIR Y，ROUGET R，AFFAREL B，et al.ATR kinase is required for global genomic nucleotide excision repair exclusively during S phase in human cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(46):17896-17901.

[16]LI Z，MUSICH P R，SERRANO M A，et al.XPA-mediated regulation of global nucleotide excision repair by ATR is p53-dependent and occurs primarily in S-phase[J].PLoS ONE，2011，6(12):28326.

[17]SHELL S M，LI Z，SHKRIABAI N，et al.Checkpoint kinase ATR promotes nucleotide excision repair of UV-induced DNA damage via physical interaction with xeroderma pigmentosum group A[J].J Biol Chem，2009，284(36):24213-24222.

[18]WU X，SHELL S M，LIU Y，et al.ATR-dependent checkpoint modulates XPA nuclear import in response to UV irradiation[J].Oncogene，2007，26(5):757-764.

[19]AL-KHALAF H H，HENDRAYANI S F，ABOUSSEKHRA A.ATR controls the p21(WAF1/Cip1)protein up-regulation and apoptosis in response to low UV fluences[J].Mol Carcinog，2011，51(12):930-938.

[20]BENDJENNAT M，BOULAIRE J，JASCUR T，et al.UV irradiation triggers ubiquitin-dependent degradation of p21(WAF1)to promote DNA repair[J].Cell，2003，114(5):599-610.

[21]ABBAS T，SIVAPRASAD U，TERAI K，et al.PCNA-dependent regulation of p21 ubiquitylation and degradation via the CRL4Cdt2 ubiquitin ligase complex[J].Genes Dev，2008，22(18):2496-2506.

[22]NIGG E A.Cyclin-dependent protein kinases:key regulators of the eukaryotic cell cycle[J].Bioessays，1995，17(6):471-480.

[23]吳平平，蘇昀，金治，等.Rho-A蛋白通路在DLC-1基因調(diào)控人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞周期中的作用及其機(jī)制[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2009，28(4):247-251.

[24]PENG C Y，GRAVES P R，THOMA R S，et al.Mitotic and G2 checkpoint control:regulation of 14-3-3 protein binding by phosphorylation of Cdc25C on serine-216[J].Science，1997，277(5331):1501-1505.

[25]KULMS D，SCHWARZ T.Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis[J].Photodermatol Photoimmunol Photomed，2000，16(5):195-201.

[26]BATISTA L F，KAINA B，MENEGHINI R，et al.How DNA lesions are turned into powerful killing structures:insights from UV-induced apoptosis[J].Mutat Res，2009，681(2-3):197-208.

[27]HEFFERNAN T P，KAWASUMI M，BLASIN A，et al.ATRChk1 pathway inhibition promotes apoptosis after UV treatment in primary human keratinocytes:potential basis for the UV protective effects of caffeine[J].J Invest Dermatol，2009，129(7):1805-1815.

[28]CHENG S Y，LUK N M，CHONG L Y.Special features of non-melanoma skin cancer in Hong Kong Chinese patients:10-year retrospective study[J].Hong Kong Med J，2001，7(1):22-28.

[29]曾紅梅，張思維，鄭榮壽，等.2003～2007年中國皮膚黑色素瘤發(fā)病與死亡分析[J].中國腫瘤，2012，21(3):183-189.