HIV患者外周血CD4+/CD25hi/ CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)及臨床意義

王兆豐 葛志堅 鮑軼 邵平揚(yáng) 陳松勁 阮玲娟

HIV患者外周血CD4+/CD25hi/ CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)及臨床意義

王兆豐 葛志堅 鮑軼 邵平揚(yáng) 陳松勁 阮玲娟

目的 探討感染人類自身免疫缺陷病毒（HIV）患者抗病毒治療前后外周血CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)情況及臨床意義。 方法 選擇符合HIV診斷標(biāo)準(zhǔn)、接受抗病毒治療超過3個月的64例患者，采用高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（HARRT），分別于治療前、治療3個月后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的表達(dá)情況，并與80例健康體檢者（對照組）比較。結(jié)果與對照組比較，HIV患者CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞絕對計數(shù)及百分比顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。HIV患者的CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞絕對計數(shù)和CD4+T細(xì)胞呈正相關(guān)（P＜0．01）；HIV患者治療3個月后CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞均有升高，與治療前的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0．01）。根據(jù)年齡將患者分為18～30歲、31～45歲、＞45歲，各年齡段患者治療后CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞絕對計數(shù)分別是治療前的4．28倍、3．00倍、2．00倍。結(jié)論HIV患者外周血CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)與病毒的感染、清除有關(guān)；外源性藥物可升高調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 HIV感染 高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate peripheral blood CD4+/CD25hi/CD127lowRegulatory T cell（Treg）levels in HIV patients after antiviral therapy and its clinical significance．MethodsSixty four HIV patients,including 18 cases aged 18～30,35 cases aged 30～45 and 11 cases aged＞45 received highly active antiretroviral therapy(HAART)．CD4+/CD25hi/CD127lowTreg and CD4+T cells in peripheral blood mononuclear cells(PBMC)were determined by flow cytometry before and 3 months after HAART．Eighty healthy individuals served as controls．ResultsBefore HAART the circulating Treg levels in HIV patients were significantly lower than those in controls(8±2．20,33±10．03,P＜0．01)．Treg was positively correlated with CD4+cells in PBMCs(r=0．81,P＜0．01)of HIV patients．The circulating levels of Treg were increased 3 months after HAART(P＜0．01);the degree of Treg cell elevation was associated with the age of patients:4．28-fold for 18～30 age group,3-fold for 30～45 age group and 2-fold for＞45 age group,respectively．ConclusionHighly active antiretroviral therapy can increase the CD4+/CD25hi/CD127lowTreg levels in HIV patients,which may be associated with the reduction of viral load．

機(jī)體感染人類自身免疫缺陷病毒（HIV）后可引發(fā)全身性的免疫失調(diào)，表現(xiàn)為CD4+T細(xì)胞的進(jìn)行性減少以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞之間的免疫失衡[1]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，能抑制自身免疫疾病的發(fā)生，在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中有一定作用[2]。CD127是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面標(biāo)志物，CD127的表達(dá)對T淋巴細(xì)胞的成熟、維持及免疫應(yīng)答發(fā)揮著重要作用。CD4+T細(xì)胞是HIV攻擊的主要細(xì)胞，當(dāng)CD4+T細(xì)胞＜200個/μl時，免疫系統(tǒng)遭到徹底破壞，免疫功能極度低下。筆者通過測定HIV患者治療前后CD4+T細(xì)胞和CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞絕對計數(shù)及百分比，探討HIV患者的發(fā)病機(jī)制和對外源性藥物的免疫應(yīng)答情況。

1 對象和方法

1.1 對象 嘉興市2005-01—2011-12符合HIV診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]、在嘉興市疾控中心接受免費(fèi)艾滋病抗病毒治療超過3個月的64例患者，男59例，女5例；年齡18～68歲，平均（39.88±9.89）歲。所有患者HIV抗體初篩、確證試驗(yàn)（WB）均為陽性，CD4+T細(xì)胞＜200個/μl，臨床診斷為艾滋病期，由本人同意并簽訂《抗艾滋病病毒藥物治療同意書》后登記并錄入國家艾滋病抗病毒藥物治療數(shù)據(jù)庫提供的《治療基本情況表》。選擇2011-01—06在嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院健康體檢者80例作為對照組，其中男55例，女25例，年齡18～62歲，平均（36.88± 9.09）歲。

1.2 儀器與試劑 流式細(xì)胞儀采用美國BD FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀FACSDiva軟件，以BD Calibrite七色校準(zhǔn)微球試劑對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)；試劑為CD4-PECY5/CD25-FITC/CD127-PE，同型對照為gG1-FITC/ IgG1-PE/IgG1-PECY5，均為美國BD公司生產(chǎn)。

1.3 方法 所有患者均使用高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（HARRT）。藥物使用國家提供的核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑藥物（NRTIs），包括齊多夫定（AZT）、拉米夫定（3TC）、司他夫定（D4T）、替諾福韋（TDF），以及非核苷反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑類藥物（NNRTs），包括奈韋拉平（NVP）、依非韋侖（EFV）[4]。每種治療方案均包含3種抗病毒治療藥物,其中2種核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和1種非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑[5]。分別于治療前和治療3個月后檢測外周血CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞絕對計數(shù)和百分比。測定步驟：使用含EDTA-K2的真空采血管采集受試對象靜脈血，對照管加入IgG1-FITC/ IgG1-PE/IgG1-PECY5 20μl，測定管加入CD4-PECY5/ CD25-FITC/CD127-PE 20μl，分別加入100 μl的枸櫞酸鈉（EDTA）抗凝新鮮全血，室溫避光孵育20min，采用CoulteRQ-PREP溶血儀溶血后上流式細(xì)胞儀檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間及治療前后的比較采用t檢驗(yàn)，CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 兩組治療前CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞絕對計數(shù)及百分比的比較 CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞絕對計數(shù)HIV患者（8.00±2.20）個/μl，對照組（33.00± 10.03）個/μl，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。CD4+/ CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分比HIV患者（2.67± 0.69）%，對照組（6.53±4.11）%，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞呈正相關(guān)（r=0.81，P＜0.01），見圖1。

圖1 HIV患者CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞的相關(guān)性

2.2 HIV患者治療前后CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比較 根據(jù)年齡將HIV患者分為18～30歲18例，其中男16例，女2例；30～45歲35例，其中男33例，女2例；＞45歲11例，其中男10例，女1例。各年齡段HIV患者治療3個月后CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞絕對計數(shù)及百分比明顯升高，治療前后的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。治療后CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞絕對計數(shù)是治療前的3.09倍、1.93倍，治療后CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞絕對計數(shù)是治療前的4.28倍、3.00倍、2.00倍，治療后CD4+T細(xì)胞絕對計數(shù)是治療前的2.30倍、2.09倍、1.41倍，見表1、圖2、3。

表1 HIV患者治療前后CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比較

3 討論

最近有研究發(fā)現(xiàn)，CD127可以作為記憶性T細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性的表面標(biāo)記物，這對效應(yīng)性T細(xì)胞向記憶性T細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、維持及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能的進(jìn)一步研究提供了重要工具，也為病毒感染的研究及治療的進(jìn)一步發(fā)展提供了重要信息[6]。本研究中發(fā)現(xiàn)HIV患者治療前CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞絕對計數(shù)和百分比均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；HIV患者CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞絕對計數(shù)與CD4+T細(xì)胞絕對計數(shù)呈正相關(guān)，說明HIV病毒感染可能與IL-7的特異性應(yīng)答有關(guān)，而IL-7在病毒感染后的免疫應(yīng)答及病毒特異性CD4和CD8記憶性T細(xì)胞庫的產(chǎn)生及維持過程中發(fā)揮重要作用[7]。

圖2 流式細(xì)胞圖（P3：CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；A：治療前；B：治療后）

圖3 各年齡段患者治療前后T細(xì)胞絕對計數(shù)的比較（A：CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；B：CD4+T細(xì)胞）

本研究中治療后CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞絕對計數(shù)是治療前的3.09倍和1.93倍。各年齡段HIV患者HARRT治療后CD4+/CD25hi/ CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞絕對計數(shù)與治療前的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），治療后CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞絕對計數(shù)分別是治療前的4.28倍、3.00倍、2.00倍，提示年輕患者比年老患者的CD4+/CD25hi/ CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞絕對計數(shù)升高幅度更大、對外源性藥物免疫應(yīng)答更強(qiáng)。CD127信號對DN期胸腺細(xì)胞的幸存和增殖起著必不可少的作用。Buckley[8]發(fā)現(xiàn)在CD127基因敲除的小鼠中，胸腺細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，T細(xì)胞和B細(xì)胞功能嚴(yán)重缺陷，而在人類中由于CD127缺陷引起的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病則僅表現(xiàn)為T細(xì)胞功能缺陷。CD127作為IL-7的受體，在T淋巴細(xì)胞的發(fā)育、T細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持及記憶性T細(xì)胞的分化及幸存等方面發(fā)揮重要的作用，在T細(xì)胞缺乏的條件下，CD127信號可以不依賴T細(xì)胞抗原受體（TCR）刺激T細(xì)胞增殖，促進(jìn)T細(xì)胞數(shù)量的恢復(fù)。臨床表明，抗病毒治療可以有效地抑制HIV的復(fù)制，減輕HIV對免疫系統(tǒng)功能的損傷，并達(dá)到免疫重建的功效，減少患者機(jī)會性感染和腫瘤的發(fā)生，提高患者的生活質(zhì)量[9]。筆者發(fā)現(xiàn)HIV病毒感染患者中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD127表達(dá)減少，可能影響T淋巴細(xì)胞的存活及功能，在治療方面，基于IL-7可以通過CD127刺激外周非同種異基因反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖，并通過抗凋亡作用保證T細(xì)胞的幸存，恢復(fù)外周T細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)外周T淋巴細(xì)胞的重構(gòu)，維持T細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[10]。

綜上所述，HIV患者外周血CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)與病毒的感染、清除有關(guān)；外源性藥物可升高調(diào)節(jié)性T細(xì)胞細(xì)胞的表達(dá)。

[1] Kinter A L,Horak R,Sion M,et al．CD25 regulatory T cells isolated from HIV-infected individuals suppress the cytolytic and nonlytic antiviral activity of HIV-specific CD8 T cells in vitro[J]．AIDS Res Hum Retroviruses,2007,23(3):438-450．

[2] 葉俏,王兆豐,吳華香．外周血CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在強(qiáng)直性脊柱炎中的意義[J]．浙江醫(yī)學(xué),2012,34(2):143-145．

[3]邵一鳴．艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標(biāo)準(zhǔn)WS 293-2008[M]．北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:9-10．

[4] 謝靜,李太生．艾滋病抗病毒治療新藥的研究進(jìn)展[J]．中國艾滋病性病雜志,2008,6(14):631．

[5] 張福杰．國家免費(fèi)艾滋病抗病毒藥物治療手冊[M]．2版．北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:109．

[6] 孫晨鳴,馬海霞,劉偉光,等．CD127與淋巴細(xì)胞[J]．中國生物工程雜志,2007,27(5):113-119．

[7] Kondrack R M,Harbertson J,Tan J T,et al．Interleukin 7 regulates the survival and generation of memory CD4 cells[J]．J Exp Med,2003,198(12):1797-1806．

[8] Buckley R H．Molecular defects in human severe combined immuneodeficiency and approaches to immunereconstitution[J]．Annu Rev Immuno,2004,22(6):625-655．

[9] Wold Health Organization．WHO case definitions of HIV for surveillance and revised clinical staging and immunological classifiation of HIV-related disease in adults and children[M]．Geneva: World Health Organization,2006:8-11．

[10] Alpdogan O,Murilan S J,Eng J M,et al．IL-7 enhances peripheral T cell reconstitution after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation[J]．J Clin Invest,2003,112(7):1095-1107．

Peripheral CD4+/CD25hi/CD127lowTreg cell levels in HIV patients after antiviral therapy and its significance

Treg HIV infection Highly active antiretroviral therapy

2013-01-18）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

314000 嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室（王兆豐、鮑軼、邵平揚(yáng)、陳松勁、阮玲娟）；嘉興市疾控中心檢驗(yàn)科（葛志堅）

葛志堅,E-mail:phgzj@163.com